[發明專利]lncRNA 068在診斷或治療惡性黑色素瘤方面的應用

在審

• 申請號: 202110062199.0
• 申請日: 2021-01-18
• 公開（公告）號: CN112760377A
• 公開（公告）日: 2021-05-07
• 發明（設計）人: 姚曉東;姚麗麗
• 申請（專利權）人: 南通大學附屬醫院
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;A61K31/7088;A61P35/00;A61P35/04;C12Q1/02;G01N33/68
• 代理公司: 北京科家知識產權代理事務所(普通合伙) 11427
• 代理人: 徐思波

1.一種診斷惡性黑色素瘤的生物標志物，其特征在于，所述生物標志物為lncRNA 068。

2.根據權利要求1所述的一種診斷惡性黑色素瘤的生物標志物，其特征在于，lncRNA068的低表達提示惡性黑色素瘤的可能性。

3.一種治療惡性黑色素瘤的藥物，其特征在于，所述藥物具有過量lncRNA 068的表達，抑制了上皮間葉轉化，影響惡性黑色素腫瘤的發生。

4.根據權利要求3所述的一種治療惡性黑色素瘤的藥物，其特征在于，包括lncRNA 068的特異性小干擾RNA的si-LncRNA 068-1、si-LncRNA 068-2、si-LncRNA 068-3中的一種或多種；其中，

si-LncRNA 068-1的序列為：GATTACCTCTTGCTAATAA；

si-LncRNA 068-2的序列為：GTTACCTTTCACAGTTCTA；

si-LncRNA 068-3的序列為：GGAGAAGATTCTAGATCCT。

5.lncRNA 068在診斷或治療惡性黑色素瘤方面的應用，其特征在于，包括以下過程：

S1、材料準備：人來源的惡性黑色素腫瘤細胞系A357和高糖DMEM培養基；

S2、過表達實驗：將細胞A357種植于六孔板中，每孔細胞種植密度一致，一孔為轉染了pcDNA3.1+空質粒的空質粒對照組，一孔為轉染了pcDNA3.1+-lncRNA 068過表達質粒的處理組；對空質粒對照組和處理組進行細胞遷移檢測、劃痕檢測、細胞免疫熒光驗證lncRNA068是否對惡性黑色素腫瘤的發生有作用；通過western blot檢測驗證lncRNA 068是否通過影響炎癥的發生及EMT過程影響惡性黑色素腫瘤的發生；

S3、敲降實驗：將細胞種植于六孔板中，每孔細胞種植密度一致，一孔為對照組，一孔為轉染了lncRNA 068的特異性小干擾RNA的小干擾實驗組；三對特異性siRNA序列分別如下：

si-LncRNA 068-1:GATTACCTCTTGCTAATAA；

si-LncRNA 068-2:GTTACCTTTCACAGTTCTA；

si-LncRNA 068-3:GGAGAAGATTCTAGATCCT；

對對照組及小干擾實驗組進行細胞遷移檢測、劃痕檢測、細胞免疫熒光檢測驗證lncRNA 068是否對惡性黑色素腫瘤的發生有作用；通過western blot檢測驗證lncRNA 068是否通過影響炎癥的發生及EMT過程而影響惡性黑色素腫瘤的發生。

6.根據權利要求5所述的lncRNA 068在診斷或治療惡性黑色素瘤方面的應用，其特征在于，所述步驟S1中細胞總RNA提取及基因檢測，包括以下步驟：使用Invitrogen公司Trizol試劑提取惡性黑色素腫瘤細胞A357的總RNA，再用Roche公司的逆轉錄試劑盒進行cDNA第一鏈的合成；采用Roche公司的SYBR Green Supermix來做基因表達分析，儀器為Bio-Rad公司的iQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System；分析結果采用2-△△Ct法計算mRNA水平；以18S看家基因來校準mRNA的水平。

7.根據權利要求5所述的lncRNA 068在診斷或治療惡性黑色素瘤方面的應用，其特征在于，所述步驟S2或S3中細胞遷移檢測，包括以下過程：將處于指數生長期期的各組細胞分別重新接種到Transwell小室，小室上下兩個空間培養液的血清濃度不同，上層是無血清培養，下層是高血清培養；常規培養，24小時后觀察不同處理的組別細胞遷移能力的差異，從而確定該lncRNA 068是否對惡性黑色素腫瘤的發生有作用。