[發(fā)明專利]一種確定與目的蛋白互作的下游轉(zhuǎn)錄因子及其DNA結(jié)合序列的方法和其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110060890.5
• 申請日: 2021-01-18
• 公開（公告）號: CN112813153B
• 公開（公告）日: 2022-10-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 丁琛;田莎;劉洋;秦兆宇;楊冰;吳曉暉;姚珍梅
• 申請（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 北京尚誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11322
• 代理人: 葉占洋;魯兵

本發(fā)明公開了一種確定與目的蛋白互作的下游轉(zhuǎn)錄因子的方法及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供的方法通過BioID富集來源于目的蛋白表達(dá)體系的蛋白樣本中生物素化的蛋白及與其交聯(lián)的DNA片段，進(jìn)而對富集的生物素化蛋白進(jìn)行鑒定和定量，并結(jié)合ChIP?Seq方法對富集的DNA片段進(jìn)行測序、文庫比對和豐度檢測，最終篩選并確定出與目的蛋白互作的下游轉(zhuǎn)錄因子及其DNA結(jié)合序列，具有檢測范圍寬和準(zhǔn)確可靠的優(yōu)點(diǎn)，提供的方法可以用于科學(xué)研究和藥物篩選等中。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域中下游轉(zhuǎn)錄因子的富集和鑒定的方法，具體涉及一種確定與目的蛋白互作的下游轉(zhuǎn)錄因子及其DNA結(jié)合序列的方法和其應(yīng)用，尤其涉及一種結(jié)合利用BioID和ChIP-Seq快速富集、鑒定、定量和篩選激酶下游弱的、瞬時互作的轉(zhuǎn)錄因子及其DNA結(jié)合序列的方法，及其在篩選對與目的蛋白相關(guān)的生物學(xué)通路起到激活或抑制作用的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

轉(zhuǎn)錄因子是指能夠結(jié)合在某基因上游特異核苷酸序列上的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)能調(diào)控其基因的轉(zhuǎn)錄。從本質(zhì)上來講，轉(zhuǎn)錄因子具有DNA序列的識別、結(jié)合以及控制基因表達(dá)的基本機(jī)能，這一機(jī)能可以單獨(dú)或者通過與其它蛋白質(zhì)形成復(fù)合體來完成。人類基因組中大約有1500個基因控制轉(zhuǎn)錄因子的編碼。然而，轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)豐度極低(僅占細(xì)胞總蛋白的0.01-0.001％)，使得對轉(zhuǎn)錄因子的純化及鑒定非常困難，如通過傳統(tǒng)色譜方法進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子的純化通常需要抽提成百升細(xì)胞培養(yǎng)物，通過10,000-100,000倍富集得到的轉(zhuǎn)錄因子也僅夠用于化學(xué)和功能的分析。采用特異性抗體進(jìn)行親和純化是分離純化轉(zhuǎn)錄因子的有效手段，然而，一方面抗體成本太高，另一方面，目前僅少量的轉(zhuǎn)錄因子存在抗體，這大大限制了抗體親和純化方法的應(yīng)用。

人類所有的蛋白并不是同時表達(dá)的，相反，很多蛋白的表達(dá)具有顯著的組織或時空特異性；同時，基因(編碼目的蛋白)的激活/去激活所必要的信號途徑通常是存在于級聯(lián)下游轉(zhuǎn)錄因子。因此，與目的蛋白(例如激酶)互作的轉(zhuǎn)錄因子(統(tǒng)稱為下游轉(zhuǎn)錄因子)會通過控制靶蛋白表達(dá)的開和關(guān)，來影響不同組織細(xì)胞、不同發(fā)育階段中靶蛋白所表達(dá)的數(shù)目及程度，因此，對下游轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行分離、鑒定，可以為闡述特異轉(zhuǎn)錄因子對靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控奠定重要基礎(chǔ)。

然而，與目的蛋白互作的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平往往很低，用傳統(tǒng)方法在蛋白質(zhì)組水平上分析下游轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)譜通常很困難。解析下游轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)譜或其動態(tài)變化時，在樣品制備過程中需要采用特定的試劑(如抗體)對下游轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行富集分離，但由于抗體的成本較高，且種類有限，采用特定抗體進(jìn)行免疫沉淀來富集分離下游轉(zhuǎn)錄因子的應(yīng)用受到很大限制；而且這種策略也僅能對個別下游轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行分析，難以實(shí)現(xiàn)對所有下游轉(zhuǎn)錄因子的大規(guī)模富集分離和鑒定，對下游轉(zhuǎn)錄因子的定量以及與其交聯(lián)的DNA結(jié)合序列的確定亦成為難題。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的一個或多個問題，本發(fā)明一個方面提供一種確定與目的蛋白互作的下游轉(zhuǎn)錄因子及其DNA結(jié)合序列的方法，包括富集、鑒定、定量和篩選的過程，具體包括以下步驟：

1)利用過表達(dá)體系過表達(dá)目的蛋白，和野生型表達(dá)所述目的蛋白；

2)利用過表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行生物素化處理和ChIP交聯(lián)制備第一蛋白樣本，利用野生型表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行生物素化處理和ChIP交聯(lián)制備第二蛋白樣本；

3)使用鏈霉親和素磁珠富集第一蛋白樣本中生物素化的蛋白及與其交聯(lián)的DNA片段，作為第一樣本；使用鏈霉親和素磁珠富集第二蛋白樣本中生物素化的蛋白及與其交聯(lián)的DNA片段，作為第二樣本；

4)使用LC-MS/MS分別對步驟3)的第一樣本和第二樣本中的生物素化的蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子的鑒定和定量；

5)比較步驟4)中獲得的第一樣本中的轉(zhuǎn)錄因子和第二樣本中的轉(zhuǎn)錄因子的定量數(shù)據(jù)，從中篩選出定量數(shù)據(jù)具有顯著差異的轉(zhuǎn)錄因子作為與目的蛋白互作的下游轉(zhuǎn)錄因子；

6)分別對步驟3)的第一樣本和第二樣本中的與生物素化的蛋白交聯(lián)的DNA片段進(jìn)行測序、文庫比對和豐度檢測；