[發(fā)明專利]可形成納米顆粒的冠狀病毒重組蛋白及其載體和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110060234.5
• 申請(qǐng)日: 2021-01-18
• 公開（公告）號(hào): CN112724209B
• 公開（公告）日: 2022-03-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 彭濤;許煜華;馮金;郭偉麗;陳麗云;鄭燕萍;王炳彰;劉雙標(biāo)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東華南疫苗股份有限公司
• 主分類號(hào): C07K14/165
• 分類號(hào): C07K14/165;C12N15/50;C12N15/866;A61K39/215;A61P31/14;G01N33/569;B82Y30/00;B82Y5/00
• 代理公司: 深圳市創(chuàng)富知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44367
• 代理人: 葉燦才

本發(fā)明公開了可形成納米顆粒的冠狀病毒重組蛋白及其載體和應(yīng)用，冠狀病毒重組蛋白為缺失至少部分C末端胞漿尾區(qū)的冠狀病毒Spiker蛋白。本發(fā)明一些實(shí)例的冠狀病毒重組蛋白，可以有效形成納米顆粒，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定并具有良好的免疫原性。本發(fā)明一些實(shí)例的冠狀病毒重組蛋白，表達(dá)量高，同時(shí)易于純化。本發(fā)明一些實(shí)例的冠狀病毒重組蛋白及其納米顆粒，有望制備成為冠狀病毒的檢測(cè)試劑原料、疫苗、抗體、預(yù)防或治療性藥物。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種重組蛋白，特別涉及可形成納米顆粒的冠狀病毒重組蛋白及其載體和應(yīng)用。

背景技術(shù)

冠狀病毒屬于套式病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、冠狀病毒屬(Coronavirus)，是許多家畜、寵物包括人類疾病的重要病原，引起多種急慢性疾病。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹，冠狀病毒可分為四個(gè)屬：α、β、γ、δ，其中β屬冠狀病毒又可分為四個(gè)獨(dú)立的亞群A、B、C和D群。

冠狀病毒感染在世界各地極為普遍。到目前為止，大約有15種不同冠狀病毒株被發(fā)現(xiàn)，能夠感染多種哺乳動(dòng)物和鳥類，有些可使人發(fā)病。除了近期爆發(fā)的新型冠狀病毒SARS-CoV-2，還有HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV等六種冠狀病毒可以感染人類，其中SARS-CoV和MERS-CoV感染后比較嚴(yán)重，分別引發(fā)重癥急性呼吸綜合征和中東呼吸綜合征。

新冠病毒(SARS-CoV-2)有四種主要的結(jié)構(gòu)蛋白：刺突蛋白(Spike protein，S蛋白)，核衣殼蛋白(Nucleocapsid，N蛋白)，膜蛋白(Membrane protein，M蛋白)，包膜蛋白(Envelope protein，E蛋白)。其中刺突蛋白S蛋白有兩個(gè)亞基：S1和S2，受體結(jié)合位點(diǎn)(RBD)位于S1亞基上。它以三聚體的形式組成病毒粒子外膜表面的刺突，其主要功能是識(shí)別宿主細(xì)胞表面受體，介導(dǎo)與宿主細(xì)胞的融合。在感染過程中，S蛋白被宿主蛋白酶(S蛋白一個(gè)福林酶酶切位點(diǎn))切割成N端的S1亞基和C端的S2亞基，并從融合前狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槿诤虾鬆顟B(tài)。

同時(shí)S蛋白及其受體結(jié)構(gòu)域RBD主要負(fù)責(zé)誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)和病毒中和抗體，是疫苗設(shè)計(jì)的關(guān)鍵抗原位點(diǎn)。在疫苗設(shè)計(jì)時(shí)，一般將S蛋白弗林酶酶切位點(diǎn)突變(氨基酸682-685)，將QQ突變?yōu)镻P(氨基酸986-987)，維持其融合前構(gòu)象，保持高免疫原性。

以RBD蛋白作為抗原研究存在一些問題，尤其是RBD蛋白分子量太小(約33kDa)，雖然容易表達(dá)和純化，但是不夠穩(wěn)定，容易降解，免疫原性偏弱，一般動(dòng)物/臨床評(píng)價(jià)需要免疫三針，且免疫劑量相對(duì)偏高。融合前的S蛋白(PDB:7JJI_A)全長(zhǎng)免疫原性較高，但是在表達(dá)分泌/定位于細(xì)胞膜時(shí)，與細(xì)胞內(nèi)的高爾基體等細(xì)胞器結(jié)合，易以包涵體存在，產(chǎn)量較低。因此在保持高免疫原性的同時(shí)，如何提高S蛋白的產(chǎn)量，具有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的至少一個(gè)不足，提供一種可形成納米顆粒的冠狀病毒重組蛋白及其表達(dá)載體和應(yīng)用。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供：

一種冠狀病毒重組蛋白，其為缺失C末端胞漿尾區(qū)末端21個(gè)氨基酸(cytoplasmictail)的冠狀病毒Spiker蛋白，記為S-△CT。

在一些實(shí)例中，所述冠狀病毒選自SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1。

在一些實(shí)例中，S-△CT的氨基酸序列如SEQ ID NO.：1所示。

本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供：

一種核苷酸序列，其可編碼本發(fā)明第一個(gè)方面所述的冠狀病毒重組蛋白。