[發(fā)明專利]脂肪酶突變體及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110059694.6
• 申請日: 2021-01-18
• 公開（公告）號: CN112375751B
• 公開（公告）日: 2021-04-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 洪浩;詹姆斯·蓋吉;肖毅;張娜;焦學(xué)成;賈如;劉文敬;劉冶
• 申請（專利權(quán)）人: 凱萊英生命科學(xué)技術(shù)（天津）有限公司
• 主分類號: C12N9/20
• 分類號: C12N9/20;C12N15/55;C12P7/40
• 代理公司: 北京康信知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11240
• 代理人: 梁文惠

本發(fā)明公開了一種脂肪酶突變體及其應(yīng)用。其中，該脂肪酶突變體具有SEQ ID NO:1所示序列發(fā)生氨基酸突變的序列，發(fā)生氨基酸突變的位點包括V154L位點。本發(fā)明的脂肪酶突變體實現(xiàn)了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的改變，其在大腸桿菌中表達的可溶性得到了明顯的改善、極大提高了酶的催化活性。在實際應(yīng)用時大大降低了酶的用量、減少了反應(yīng)體積、降低了后處理的難度，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種脂肪酶突變體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

不少手性酸類、醇類化合物（例如α-取代丙酸類化合物）是具有活性的，是手性藥物合成中重要的手性單元。酸、醇和酯類手性藥物的拆分一般是首先用化學(xué)方法合成相應(yīng)的甲酯、乙酯或丙酯等的消旋體，然后利用脂肪酶或酯酶進行立體選擇性水解從而獲得單一對映體構(gòu)型的手性單元。例如除草劑（R）-α-苯氧基丙酯、抗炎藥（S）-苯基丙醇都是通過脂肪酶的立體選擇性轉(zhuǎn)化成單一的活性異構(gòu)體。

脂肪酶具有高度的立體選擇性，可以催化手性拆分、制備單一手性醇類、胺類和酯類等有機合成中間體（脂肪酶的固定化及其手性拆分的研究進展[J].應(yīng)用化工,2011,40(10):1823-1827）。在手性藥物合成中，常用的脂肪酶包括豬胰脂肪酶、假絲酵母屬脂肪酶、假單胞桿菌屬脂肪酶和毛霉屬脂肪酶(生物催化劑在手性藥物合成中的應(yīng)用[J].氨基酸和生物資源,2013,35(4):39-42)。

例如：申請公布號為 CN 108642025 A的發(fā)明專利申請公開了來源于華根霉脂肪酶的突變體M8A，L10A，D11A，L12A，P17G的比酶活性較野生型酶的比活性提高了1.1-2.4倍，M8A、L10A、T9A的1,3-位置選擇性較野生型的酶提高了4.75-5倍。

再如： 申請公布號為CN 109750013 A的發(fā)明專利申請公開了一個來源于華根霉脂肪酶的突變體V131N，該突變體具有理想的耐熱特性，在50 ℃耐受120 min其相對酶活性大約還有66.12%，而野生型脂肪酶僅僅剩余28.24%，在60 ℃野生脂肪酶相對酶活性剩余一半時的時間大約為60 min，相應(yīng)突變體僅為25 min。

在工業(yè)化生產(chǎn)時，大多數(shù)野生型的脂肪酶催化效率低、立體選擇性差、穩(wěn)定性弱，利用基因工程手段將其在常見的工程菌中表達時存在目標(biāo)蛋白表達量低、可溶性差、催化活性弱等缺點，因此能夠真正被廣泛應(yīng)用的脂肪酶并不多。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在提供一種脂肪酶突變體及其應(yīng)用，以提高酶的活性。

為了實現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種脂肪酶突變體。該脂肪酶突變體具有SEQ ID NO: 1所示序列發(fā)生氨基酸突變的序列，發(fā)生氨基酸突變的位點包括V154L位點。

進一步地，發(fā)生氨基酸突變的位點還包括如下任意一個或多個：Q11L、T40S、T44S、Q23L、M72A、W113A、D134H/T/N、T138R、L140V/W/M/A/I、A141I/L/Q/T/V、P143A/G/I、L144G/H/P/R/S/T/D/A、L147P、S150N、P152L、S153P/T、V154K、T186A、I189L、V190I/T/Y/A、V221A、T256A、T259A、E269D、A281P、I285M/V/L/A、G307C、C311L、T316A，其中“/”表示“或”。