[發(fā)明專利]高效編輯家蠶基因組的Cas9系統(tǒng)及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110059143.X
• 申請(qǐng)日: 2021-01-15
• 公開（公告）號(hào): CN112852871A
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 潘敏慧;董戰(zhàn)旗;胡志剛;陳鵬;魯成
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/866;C12N9/22;A01K67/04
• 代理公司: 重慶航圖知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 50247
• 代理人: 王貴君

1.高效編輯家蠶基因組的Cas9系統(tǒng)，其特征在于：所述Cas9系統(tǒng)包括含有表達(dá)Cas9基因的家蠶轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體和家蠶核型多角體病毒包裝含靶序列的U6啟動(dòng)子調(diào)控sgRNA表達(dá)的表達(dá)框U6-sgRNA的病毒粒子。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述高效編輯家蠶基因組的Cas9系統(tǒng)，其特征在于：所述Cas9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述表達(dá)框U6-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述高效編輯家蠶的Cas9系統(tǒng)，其特征在于：所述Cas9基因受IE1啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述高效編輯家蠶的Cas9系統(tǒng)，其特征在于：所述含有表達(dá)Cas9基因的家蠶轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體含有由OpIE2啟動(dòng)子調(diào)控Cas9表達(dá)的表達(dá)框和OpIE2啟動(dòng)子調(diào)控Mcherry表達(dá)的表達(dá)框。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述高效編輯家蠶的Cas9系統(tǒng)，其特征在于：所述病毒粒子由以下方法制備：將含有靶序列的表達(dá)框U6-sgRNA的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH10bac(BmNPV)感受態(tài)細(xì)胞，在Tn7轉(zhuǎn)座子作用下轉(zhuǎn)座到BmNPV基因組上，形成重組桿粒BEV-U6-sgRNA；提取重組桿粒轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞，收集P1代病毒粒子，再次感染，收集P2代病毒粒子即可。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述高效編輯家蠶的Cas9系統(tǒng)，其特征在于：所述含靶序列表達(dá)框U6-sgRNA的重組質(zhì)粒由以下方法構(gòu)成：將SEQ ID NO.2所示序列通過BamHI和EcoRI酶切后插入到pFastBac-Dual-HSP^prm-EGFP-poly載體上，獲得載體pFBD-U6-sgRNA，然后將靶基因的sgRNA通過酶切位點(diǎn)BbsI連入pFBD-U6-sgRNA載體，獲得含有靶序列的U6-sgRNA的重組質(zhì)粒。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述高效編輯家蠶的Cas9系統(tǒng)，其特征在于：所述靶基因的sgRNA為病毒基因lef11的sgRNA，宿主基因HSPD1的sgRNA和ATAD3A的sgRNA；所述病毒基因lef11的sgRNA為SEQ ID NO.14與SEQ ID NO.15退火形成的雙鏈DNA序列；所述宿主基因HSPD1的sgRNA為SEQ ID NO.16與SEQ ID NO.17退火形成的雙鏈DNA序列；所述ATAD3A的sgRNA為SEQID NO.18與SEQ ID NO.19退火形成的雙鏈DNA序列。

8.權(quán)利要求1～7任一項(xiàng)所述高效編輯家蠶的Cas9系統(tǒng)在編輯家蠶基因組或家蠶核型多角體病毒基因中的應(yīng)用。

9.利用權(quán)利要求1～7任一項(xiàng)所述Cas9系統(tǒng)高效編輯家蠶基因組的方法，其特征在于：將含有表達(dá)Cas9基因的家蠶轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體注入家蠶蠶卵，篩選轉(zhuǎn)基因家蠶，獲得Cas9轉(zhuǎn)基因家蠶；然后將家蠶核型多角體病毒包裝含U6啟動(dòng)子調(diào)控sgRNA表達(dá)的表達(dá)框U6-sgRNA的病毒粒子注射Cas9轉(zhuǎn)基因家蠶，獲得高效編輯家蠶基因組。