[發明專利]用于細胞內pH和氧氣濃度同時測量的雙參數熒光納米傳感器及其制備方法

有效

• 申請號: 202110058817.4
• 申請日: 2021-01-17
• 公開（公告）號: CN112881355B
• 公開（公告）日: 2022-03-18
• 發明（設計）人: 王旭東;連瑩
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;陸尤

本發明屬于生物pH和氧氣濃度熒光檢測的技術領域，具有為用于細胞內pH和氧氣濃度同時測量的雙參數熒光納米傳感器及其制備方法。本發明熒光納米傳感器是聚苯乙烯納米顆粒，其內部疏水，包埋有氧敏感探針，以及pH和氧氣惰性的參比熒光探針，其表面修飾有氨基基團，并通過共價連接方式在納米顆粒表面修飾pH敏感探針。該傳感器采用一鍋法聚合反應合成得到。該熒光納米傳感器具有生物相容性好、制備簡單、靈敏度好、可逆性好的優點，在適當波長的激發光照射下，傳感器暴露在不同pH和不同氧濃度環境中，其熒光強度會發生明顯變化，可用于細胞內pH和氧氣濃度的同時測量。比率型檢測方法熒光檢測的準確性更高，且細胞毒性極低。

技術領域

本發明屬于生物pH和氧氣濃度熒光檢測的技術領域，具有涉及一種用于細胞內pH和氧氣濃度同時測量的雙參數熒光納米傳感器及其制備方法。

背景技術

細胞作為組成生命體的最基本單元，保持細胞功能正常對于維持生命體的健康十分重要。細胞的功能失調與一系列疾病的產生息息相關，如肥胖癥、神經性疾病和癌癥等。細胞生理活動所需的能量大部分都來源于線粒體呼吸作用。氧氣在線粒體呼吸作用的氧化磷酸化環節至關重要，其與還原性分子反應生成水并釋放大量能量。能量通過電子傳遞鏈傳遞，驅動了質子逆濃度梯度運輸，從而產生線粒體膜電勢。質子通過化學滲透的方式回流，釋放的能量驅動ATP合成酶的部分旋轉，從而將二磷酸腺苷（ADP）轉化為三磷酸腺苷（ATP）。此外，氧氣濃度過低會引起線粒體功能障礙，而氧氣濃度過高可能會促進細胞內活性氧的產生，損害生物分子。同時，細胞內的質子還參與了許多細胞內其他的重要生理活動，例如鈣離子信號傳導。因此，同時檢測細胞內的pH和氧氣濃度對于監控細胞生理活動和功能狀態具有重要的意義。

熒光傳感器由于其檢測速度快、靈敏度高、成本低以及對樣品無損等特性近年來受到了研究者的青睞。彭洪尚課題組報告了一種具有細胞線粒體靶向性的熒光氧氣納米傳感器（CN103575717B），該傳感器是以十二烷基三甲氧基硅烷-聚苯乙烯和二氧化硅為核，以多聚賴氨酸為殼的核殼結構，氧氣探針分散在核層中，通過靜電吸附作用表面偶聯線粒體靶向基團。雖然其具有較好的氧氣響應性能，但是通過沉淀法制備的聚合物納米顆粒尺寸分布比較不均勻，且顆粒表面呈現化學惰性，難以以共價的方式在納米顆粒表面修飾其他熒光探針或者靶向基團。雖然具有氧濃度檢測功能的熒光傳感器可與具有pH檢測功能的傳感器共同使用實現pH和氧氣濃度的同時測定，但是由于傳感器在細胞內的分布位置不同，使用多種傳感器不利于對細胞內同一位置處的pH和氧氣濃度同時進行檢測，并且引入多個傳感器會增加對細胞正常生理活動的干擾。我們課題組曾報告過一種超小尺寸高穩定性的細胞內pH和氧氣同時檢測的熒光納米傳感器(Wang et al., 2012)，其將普朗尼克聚合物溶解在水溶液形成核殼結構的膠束，內部疏水包埋了氧敏感探針，外部親水的PEG層連接pH敏感探針，然后通過在表面形成一層薄二氧化硅來固化結構。獨特的結構使其具有良好的pH和氧氣檢測性能，但是由于其致密的PEG結構，納米顆粒無法通過胞吞的方式進入細胞，只能通過電穿孔或者顯微注射的方式進入細胞。因此，有必要開發一種生物相容性好、制備簡單、靈敏度好、可逆性好，能方便地進入細胞并用于細胞內pH和氧氣濃度同時測量的雙參數熒光納米傳感器。

發明內容

本發明的目的在于提供一種生物相容性好、制備簡單、靈敏度好、可逆性好，能用于細胞內pH和氧氣濃度同時測量的雙參數熒光納米傳感器及其制備方法。

本發明提供的用于細胞內pH和氧氣濃度同時測量的雙參數熒光納米傳感器，是一種聚苯乙烯納米顆粒，其內部疏水，包埋有氧敏感探針，以及pH和氧氣惰性的參比熒光探針，其表面修飾有氨基基團，并通過共價連接方式在納米顆粒表面上修飾pH敏感探針；聚苯乙烯材料具有良好的氧氣通透性，通過將氧敏感探針和參比熒光染料包裹在納米顆粒內部，可有效地減少外部環境對熒光檢測的干擾，提升氧氣檢測的準確度。將檢測質子濃度的pH敏感探針修飾在納米顆粒表面，使得其可以充分與外部環境中的質子接觸，有利于提升納米傳感器的響應性能。所述的三種熒光探針的發射光譜沒有較大發射光譜重疊，可準確地對pH和氧氣濃度進行檢測。所述的熒光納米傳感器具有均勻的尺寸，良好的生物相容性，可實現細胞內pH和氧氣濃度的同時檢測。