[發明專利]一種仿生子宮內膜及其制備方法

在審

• 申請號: 202110057294.1
• 申請日: 2021-01-15
• 公開（公告）號: CN112717203A
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發明（設計）人: 肖雁冰;蔣成素;楊定英
• 申請（專利權）人: 肖雁冰
• 主分類號: A61L27/36
• 分類號: A61L27/36;A61L27/38;A61L27/50
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 劉妮

1.一種仿生子宮內膜，其特征在于：包括兩組呈鏡面對稱的BAM(仿生羊膜)，兩組所述BAM(仿生羊膜)之間設置有ESC(子宮內膜間質細胞)。

2.應用于權利要求1的一種仿生子宮內膜的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

步驟一：制備hAAM(人脫細胞羊膜)

從正常孕婦婦剖宮產手術中獲取人新鮮羊膜組織，再經鹽水充分漂洗除去血跡和表面可能粘附的其他雜質后與戊二醛交聯過夜，再使用胰蛋白酶充分消化2次，每次的時間為30min-40min，將新鮮羊膜表皮細胞消化至松解狀態，之后再用生理鹽水輕柔漂洗3次，去除多余的胰蛋白酶，即得到hAAM，然后將制成的hAAM冷凍干燥、分裝，將其用環氧乙烷滅菌后置于-20℃條件下冷凍備用；

步驟二：提取hAMSCs(人羊膜間充質干細胞)

將新鮮羊膜剪碎至1mm大小碎片后，加入胰蛋白酶消化2次，每次的時間為30min，之后加入Ⅱ型膠原酶消化1h，收集細胞濾液并離心，重懸于含10％胎牛血清的DMEM/F12培養基中，之后在37℃孵箱中恒溫孵育，培養液每2d更換1次，當細胞融合達到80％時，胰蛋白酶消化，1:3傳代；

步驟三：制備AAM(人工羊膜)

用無血清的DMEM/F12培養基按1:3稀釋BD基質膠后分裝入凍存管中保存。實驗前在冰浴中融化預先分裝的BD基質膠，于冰上將步驟二中提取的hAMSCs與基質膠按1:1混合注入24孔板中，制成底面積為2cm2、厚度約3-5mm、細胞濃度為3×105/ml的圓形薄膜，即得到AAM；

步驟四：制備BAM(仿生羊膜)

先將一片所述步驟一中得到的hAAM(網孔面向上)置于Transwell小室底部，在其上加一片所述步驟三中得到的AAM，再將另一片所述步驟一中得到的hAAM(網孔面向下)覆蓋于AAM上，即得到BAM；

步驟五：制備ESC(子宮內膜間質細胞)

刮取少許全子宮切除術后子宮的內模組織，用含有1％青鏈霉素的基礎培養基反復洗滌內膜組織，每次5min，共洗滌3次，隨后用不含有青鏈霉素的培養基洗滌1次，再用長組織剪將內膜組織剪成2mm3左右的小碎塊，并1000r/min離心1次，之后在含有組織塊的離心管中加入5倍體積含1％I型膠原酶的基礎培養基，吹打混勻，置于37℃、5％CO2培養箱中進行首次消化，每隔10min震蕩1次，1小時后取出，之后將首次消化液經100um孔徑的細胞濾網過濾一次，過濾所得濾液經40um孔徑的細胞濾網二次過濾，濾出的液體(主要為ESC)移入新的離心管，1200r/min離心5分鐘，去上清，用完全培養基漂洗1次后接種于細胞培養瓶。

3.根據權利要求2所述的一種仿生子宮內膜的制備方法，其特征在于：所述步驟一中和步驟二中胰蛋白酶均為0.25％質量分數的胰蛋白酶。

4.根據權利要求2所述的一種仿生子宮內膜的制備方法，其特征在于：所述步驟一中新鮮羊膜表皮細胞消化的過程中，須在倒置顯微鏡下觀察，當上皮層細胞松解、脫落率達80％以上時停止消化。

5.根據權利要求2所述的一種仿生子宮內膜的制備方法，其特征在于：所述步驟二中DMEM/F12培養基內還含有100U/mL青鏈霉素。

6.根據權利要求2所述的一種仿生子宮內膜的制備方法，其特征在于：所述步驟三中BD基質膠的濃度為50ul/cm2生長面積。

7.根據權利要求2所述的一種仿生子宮內膜的制備方法，其特征在于：所述步驟五中過濾后濾網上殘留的組織塊放入原離心管內，加入含1％I型膠原酶的基礎培養基進行二次消化，二次消化時間可延長至90min，且二次消化所得濾液中ESC提取方式與首次相同。