[發明專利]一種肝細胞超聲波植冰凍存裝置及其凍存方法

在審

• 申請號: 202110051726.8
• 申請日: 2021-01-09
• 公開（公告）號: CN112674078A
• 公開（公告）日: 2021-04-20
• 發明（設計）人: 李維杰;申敬;宋立勇;劉寶林;漆琴
• 申請（專利權）人: 上海理工大學
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種用于在低溫冷凍前對待冷凍細胞進行超聲波植冰凍存的裝置，其特征在于：

包括超聲容器，溫度控制系統，超聲波誘導成核系統，冷卻系統；

其中，所述的超聲容器包括若干樣本槽管(12)，若干細胞凍存管(11)和若干對照凍存管(10)、超聲內盒體(3)，所述的細胞凍存管11盛放于樣本槽管(12)，所述的對照凍存管10盛放于另一樣本槽管(12)，樣本槽管(12)、若干細胞凍存管(11)和若干對照凍存管(10)均位于超聲內盒體(3)中，第一控溫相變液(4)填充在超聲內盒體(3)中，樣本槽管(12)被超聲內盒體(3)中的第一控溫相變液(4)浸沒，通過第一控溫相變液(4)的溫度變化調整樣本槽管(12)中的溫度，進而實現對細胞凍存管(11)和對照凍存管(10)的溫度控制；

所述的溫度控制系統包括若干熱電偶電極和溫度數據采集模塊(9)；

所述的冷卻系統包括第一控溫相變液(4)和第二控溫相變液(5)，第一控溫相變液(4)填充在超聲內盒體(3)中，第二控溫相變液(5)填充在低溫恒溫槽(6)中。

2.根據權利要求1所述的裝置，其特征在于：所述的超聲波誘導成核系統，包括超聲波發生器(1)和若干超聲波振子(2)，超聲波振子(2)的數量與樣本槽管(12)的數量相匹配，每個樣本槽管(12)的底部均粘結至少一個超聲波振子(2)，當超聲波發生器(1)啟動后，超聲波振子(2)開始工作，超聲波從樣本槽管(12)底部快速向上傳播到細胞凍存管(11)和對照凍存管(10)中；

所述的超聲容器內第一控溫相變液(4)和低溫恒溫槽內第二控溫相變液(5)設置一個閉合循環回路，超聲容器(3)內的溫度分布均勻，低溫恒溫槽(6)內的溫度分布均勻，低溫恒溫槽(6)自帶制冷循環系統。

3.一種肝細胞超聲波植冰凍存方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)、培養肝細胞：采用胎牛血清的1640培養基培養L-02肝細胞獲得肝細胞培養液備用：

(2)、確定植冰溫度上閾：采用差式掃描量熱儀(DSC)分別測量Me₂SO保護劑的結晶溫度，之后確定植冰溫度上閾；

(3)、選取控溫相變液原料：選取20-55％濃度乙二醇溶液為第一控溫相變液(4)和第二控溫相變液(5)原料；

(4)、超聲波植冰凍存肝細胞：將肝細胞培養液分裝到凍存管，之后放置在超聲波植冰裝置的樣本槽中進行植冰冷凍保存，經復蘇、計數和存活率測定，肝細胞凍存后復蘇存活率高于90％。

4.根據權利要求3所述的一種肝細胞超聲波植冰凍存方法，其特征在于：所述的冷凍保護劑為0％～15％Me2SO，所述的植冰溫度為-3℃～-12℃，所述的超聲波功率為25～200W。

5.根據權利要求3或4所述的一種肝細胞超聲波植冰凍存方法，其特征在于：超聲波植冰凍存時，首先將搭載好的超聲容器與低溫恒溫槽連接，將配制好的乙二醇控溫相變液注入超聲內盒體和低溫恒溫槽中，開啟低溫恒槽的制冷循環系統，待第二熱電偶監測到超聲容器內控溫相變液溫度達到指定需要的溫度并保持恒溫狀態，通過第一熱電偶實時監測凍存管溫度，當凍存管溫度達到指定植冰溫度時，啟動超聲波發生器電源，超聲波啟動，植冰結束后關閉超聲波，細胞凍存管在控溫相變液中平衡5-10min使冰晶生長完全，平衡結束之后蓋上降溫盒的蓋子，將降溫盒轉移至-50--80℃冰箱進行低溫保存過夜，第二天再將凍存管轉移至液氮凍存24-48h。

6.根據權利要求3或4所述的一種肝細胞超聲波植冰凍存方法，其特征在于：所述的植冰上閾溫度與Me2SO濃度有如下關系：y＝33.808x2-62.936x-4.0311，R²＝0.9988，其中x代表Me2SO濃度，y為植冰上閾溫度。

7.根據權利要求3或4所述的一種肝細胞超聲波植冰凍存方法，其特征在于：所述的超聲波植冰凍存參數為：保護劑為5％Me2SO，超聲波功率為60W，植冰溫度為-7℃，-8℃，-9℃；或者，所述的超聲波植冰凍存參數為：超聲波植冰功率為60W，保護劑為0％Me2SO，3％Me2SO，5％Me2SO。