[發明專利]BnaSVP基因在調控油菜花期中的應用、具有不同開花期的油菜突變體材料的制備方法

有效

• 申請號: 202110049541.3
• 申請日: 2021-01-14
• 公開（公告）號: CN112608930B
• 公開（公告）日: 2022-12-13
• 發明（設計）人: 范楚川;周永明;翟云孤;黃會斌;許磊
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C07K14/415;C12N15/82;C12N15/84;A01H5/02;A01H6/20
• 代理公司: 北京金智普華知識產權代理有限公司 11401
• 代理人: 楊采良

1.具有不同開花期的油菜突變體材料的制備方法，其特征在于：克隆BnaSVP的基因組序列，利用CRISPR/CAS9技術靶向BnaSVP的四個同源拷貝，獲得突變體，所述突變體材料由所述的BnaSVP的同源拷貝中BnaA09.SVP的單拷貝突變，BnaA09.SVP和BnaC04.SVP兩個拷貝同時突變，BnaA09.SVP和BnaC08.SVP兩個拷貝同時突變，BnaA04.SVP、BnaA09.SVP和BnaC08.SVP三個拷貝同時突變，及BnaSVP的四個拷貝同時突變所產生的基因編碼區內的核苷酸序列突變獲得；

其中，所述BnaSVP基因的四個拷貝的核苷酸序列分別為：SEQ ID NO.1所示的BnaA09.SVP，SEQ ID NO.2所示的BnaA04.SVP，SEQ ID NO.3所示的BnaC08.SVP，SEQ IDNO.4所示的BnaC04.SVP;

所述BnaA09.SVP的氨基酸序列見SEQ ID NO.5，所述BnaA04.SVP的氨基酸序列見SEQID NO.6，所述BnaC08.SVP的氨基酸序列見SEQ ID NO.7，所述BnaC04.SVP的氨基酸序列見SEQ ID NO.8。

2.根據權利要求1所述的具有不同開花期的油菜突變體材料的制備方法，其特征在于：

所獲突變體單株為：BnaSVP17-5 aa1aa2cc1cc2 、BnaSVP29-3 aa1aa2CC1cc2 、BnaSVP52-11 aa1aa2cc1cc2 、BnaSVP48-3 AA1aa2cc1CC2 、BnaSVP38-5 AA1aa2CC1cc2 、BnaSVP25-8 AA1aa2CC1CC2。

3.獲取如權利要求2中所述的突變體單株的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1：獲取BnaSVP基因片段；

步驟2：針對BnaSVP基因的核苷酸序列設計sgRNA，并構建載體；

步驟3：將步驟2中構建的載體轉化至油菜株系中，獲得突變體油菜株系；

步驟4：對突變體油菜株系進行檢測并測序，確定株系基因型；

步驟5：獲得的突變體油菜株系種植并自交分離，獲得BnaA09.SVP的單拷貝突變，BnaA09.SVP和BnaC04.SVP兩個拷貝同時突變，BnaA09.SVP和BnaC08.SVP兩個拷貝同時突變，BnaA04.SVP、BnaA09.SVP和BnaC08.SVP三個拷貝同時突變，及BnaSVP的四個拷貝同時突變的突變體材料；

步驟2中設計四個sgRNA，其中S1，S2，S3靶向BnaA04.SVP拷貝，S1，S2，S4靶向BnaA09.SVP，BnaC04.SVP和BnaC08.SVP拷貝。

4.根據權利要求3所述的獲取突變體單株的方法，其特征在于，獲得的純合突變體的sgRNA序列為：

BnaSVP17-5 aa1aa2cc1cc2

S1

ATGAGAGGAGAGGAACTTCAAGG wt

a1 ATGAGAGGAGAGGA----CAAGG -4bp

S2

CCGTTC--TCTGCGACGCTGATGTT wt

a2-1 CCGTTCT-TCTGCGACGCTGATGTT +A

c1-1 CCGTTCTATCTGCGACGCTGATGTT +2bp

c1-2 CCGTTC------CGACGCTGATGTT -4bp

c2-1 CCGTTCT-TCTGCGACGCTGATGTT +T

c2-2 CCGTTC---CTGCGACGCTGATGTT -T

BnaSVP29-3 aa1aa2CC1cc2

S1

ATGAGAGGAGAGGAACTTCAAGG wt

a1 ATGAGAGGAGAGG------AAGG -6bp

S2

CCGTTC-TCTGCGACGCTGATGTT wt

a2 CCGTTCTTCTGCGACGCTGATGTT +T

c2-1 CCGTTCTTCTGCGACGCTGATGTT +T/58%

c2-2 CCGTTC-T—GCGACGCTGATGTT -2bp/42%

S4

CGAGAGAGAAGATTCAG-ATCAGG wt

a2 CGAGAGAGAAGATTCAGTATCAGG +T

c2 /--------------------AGG -31bp

BnaSVP52-11 aa1aa2cc1cc2

S1

ATGAGAGGAGAGGGAACTTCAAGG wt

a1-1 ATGAGAGGAGAGGGAAC-TCAAGG -T/60%

a1-2 ATGAGAGGAGAGGGAAC----AGG -4bp/40%

a2 ATGAGAGGAGAGGG-----CAAGG -5bp

S2

CCGTTCT--CTGCGACGCTGATGTT wt

a2-1 CCGTTCTTACTGCGACGCTGATGTT +2bp/74%

a2-2 CCGTTCT---TGCGACGCTGATGTT -C/10%

c1-1 CCGTTCTA-CTGCGACGCTGATGTT +A/45%

c1-2 CCGTT------GCGACGCTGATGTT -4bp/55%

c2 CCGTTCT-------ACGCTGATGTT -5bp

BnaSVP48-3 AA1aa2cc1CC2

S2

CCGTTC-TCTGCGACGCTGATGTT wt

a2 CCGTT----TGCGACGCTGATGTT -3bp

c1 CCGTTCTTCTGCGACGCTGATGTT +T

S4

CGAGAGAGAAGATTCAGATCAGG wt

c1 CGAGAGAGAAGAT-----TCAGG -5bp

BnaSVP38-5 AA1aa2CC1cc2

S2

CCGTTCT--CTGCGACGCTGATGTT wt

a2-1 CCGTTCTA---GCGACGCTGATGTT +A/60%

a2-2 CCGTTCT----GCGACGCTGATGTT -2bp/40%

c2 CCGTTCTATCTGCGACGCTGATGTT +2bp

BnaSVP25-8 AA1aa2CC1CC2

S2

CCGTTC-TCTGCGACGCTGATGTT wt

a2-1 CCGTTCTTCTGCGACGCTGATGTT +T/43%

a2-2 CCG--------------------/ -28bp/57%。