[發明專利]用于外泌體檢測的熒光共振能量轉移磁傳感器及制備方法

有效

• 申請號: 202110048871.0
• 申請日: 2021-01-14
• 公開（公告）號: CN112858680B
• 公開（公告）日: 2022-10-04
• 發明（設計）人: 易強英;朱南行;吳堯;李國浩
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574;C12Q1/6818;G01N21/64;G01N33/533
• 代理公司: 北京正華智誠專利代理事務所(普通合伙) 11870
• 代理人: 何凡

本發明公開了一種用于外泌體檢測的熒光共振能量轉移磁傳感器及制備方法，該傳感器包括帶有熒光的Fe@QD@Apt和DNA修飾的金納米粒子，該帶有熒光的Fe@QD@Apt和DNA修飾的金納米粒子通過互補配對DNA與Apt組裝在一起。本發明基于熒光能量共振轉移技術，檢測方法具有方便快捷、價格低廉、超低檢測限的特點，為液體活檢應用提供重要思路。

技術領域

本發明屬于生化檢測技術領域，尤其涉及一種用于外泌體檢測的熒光共振能量轉移磁傳感器及制備方法。

背景技術

作為一種活細胞釋放的細胞外囊泡，外泌體從其母細胞繼承了大量生物物質，并積極參與細胞間，細胞間環境的通訊，并在生理和病理過程中發揮重要作用。由于其獨特的起源，豐富的生物學信息以及分離后的良好穩定性，外泌體已成為具有廣泛應用前景的生物標志物。外泌體上特異性或過表達的蛋白質描述與疾病的發生和發展密切相關。例如，黑色素瘤細胞衍生的外泌體表達高水平的PD-L1蛋白，從而干擾免疫細胞的活性以抑制免疫系統。這種影響與過度表達的上皮惡性腫瘤標志物EpCAM對上皮惡性腫瘤(典型的是結腸癌，食道癌，胃癌，肝細胞癌和肺癌)相似。在此基礎上，系統地鑒定外泌體并解決外泌體上相應特征蛋白(例如EpCAM)的差異水平，可以解決當前對有效和準確預測癌癥以及實時監測療效和預防轉移的挑戰。

要分析外泌體，對其的高效分離應該是第一步。盡管有各種方法(例如蛋白質印跡，酶聯免疫吸附測定，聚合酶鏈反應)，儀器(質譜，流式細胞儀，拉曼光譜)和其它生物學方法檢測外泌體，其局限性是顯而易見的。比如，需要大量樣品，昂貴且專用的儀器，專業的操作人員，繁瑣的操作步驟，昂貴的試劑的要求，無疑會阻礙其在及時、經濟的體外診斷中的廣泛應用。

發明內容

本發明的目的在于：針對上述現有技術中存在的不足，提供一種用于外泌體檢測的熒光共振能量轉移磁傳感器及制備方法。

本發明采用的技術方案如下：

一種用于外泌體檢測的熒光共振能量轉移磁傳感器的制備方法，包括以下步驟：

S1.向含5-15mg/mL的表面帶羧基的超順磁Fe3O4納米粒子的PBS緩沖液中加入0.5-1.5mg PEI，振蕩1-2h后磁分離，得到Fe@PEI；再加入含有0.2-1μL羧基量子點的硼酸鹽緩沖液，得到Fe@QD；

S2.向50-70μM PAA溶液中加入100-150μM EDC和220-250μM NHS，活化1-2h后，加入5-15μM適配體，37℃振蕩10-15h，得到PAA-Apt；

S3.向S1中所得Fe@QD加入PEI溶液再修飾一層PEI，磁分離后加入S2所得PAA-Apt，振蕩30-50min后磁分離棄去上清液，于PBS緩沖液中重懸，得到Fe@QD@Apt；

S4.向含15-25μM巰基-DNA的醋酸鹽緩沖液加入5-15mM TCEP，25℃孵育1-2h，再加入10-15nm的金納米粒子，室溫反應13-18h，逐滴加入醋酸鹽緩沖液，然后加入1-2M NaCl溶液，得到Au-DNA；

S5.向S3所得Fe@QD@Apt懸浮液中加入PBS緩沖液，然后滴加S4所得Au-DNA，在37℃下孵育4-5h，用PBS緩沖液清洗，即得。

本發明的傳感器基于熒光能量共振轉移(FRET)技術，分為兩個部分，第一部分是帶有熒光的Fe@QD@Apt，其中，外圍的Apt為可特異性識別某種特定抗原的適配體。第二部分是DNA修飾的金納米粒子，這一段DNA可與第一部分的Apt部分互補配對，因此這兩個部分可以通過互補配對組裝在一起，與此同時第一部分的熒光發射峰處在金納米粒子的吸收峰內，兩者發生熒光能量共振轉移(FRET)，因此組裝體的熒光強度大幅降低，在檢測到外泌體后，外泌體會特異性結合適配體Apt，從而撕裂與Au的結合，FRET被打斷，從而熒光強度上升，實現熒光的“點亮”，從而來達到檢測外泌體的目的。