[發明專利]lmo2733作為靶點在制備檢測、鑒別或診斷單增李斯特菌的試劑中的應用

在審

• 申請號: 202110048682.3
• 申請日: 2021-01-14
• 公開（公告）號: CN112662792A
• 公開（公告）日: 2021-04-16
• 發明（設計）人: 王菊芳;張旭;孫秋麗;馬毅
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 崔紅麗

1.lmo2733作為靶點在制備檢測、鑒別或診斷單增李斯特菌的試劑中的應用。

2.一種用于檢測單增李斯特菌的試劑，其特征在于：包含能夠檢測lmo2733的引物。

3.根據權利要求2所述的用于檢測單增李斯特菌的試劑，其特征在于：

能夠檢測lmo2733的引物為PCR引物組，包括：

上游引物F：5′-GCAGCATTGATCCAACAAATG-3′；

下游引物R：5′-CGTAGCGTACGAAGATATTCG-3′。

4.根據權利要求2所述的用于檢測單增李斯特菌的試劑，其特征在于：

能夠檢測lmo2733的引物為LAMP引物組，包括：

上游外引物F3：5′-GGTTTATTGCCATAGGAGAGG-3′；

上游內引物FIP：5′-GTAACCGCACCAAGAGAAGCGCTACAAAATCCGCTTATCAC-3′；

下游內引物BIP：5′-TACTTGGTGCAGTACAATGGCGCCCAGAAATTTTCAACGAG-3′；

下游外引物B3：5′-ACAATTAAACCGATCGCATAG-3′。

5.權利要求2～4任一項所述的用于檢測單增李斯特菌的試劑在制備檢測、鑒別或診斷單增李斯特菌的試劑盒中的應用。

6.一種用于檢測單增李斯特菌的試劑盒，其特征在于：含有權利要求2～4任一項所述的用于檢測單增李斯特菌的試劑。

7.一種檢測單增李斯特菌的方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)提取樣品DNA；

(2)以步驟(1)的樣品DNA為模板，利用權利要求2～4任一項所述的用于檢測單增李斯特菌的試劑進行PCR反應或LAMP反應；

(3)將步驟(2)得到的PCR反應產物進行電泳檢測，若擴增到目標條帶，則為單增李斯特菌陽性；若未擴增到任何條帶，則為不含單增李斯特菌的陰性；

(4)將步驟(2)得到的LAMP反應產物進行肉眼可視化觀察，采用HNB染料作為顯色劑時，若產物顏色為天藍色，則為單增李斯特菌陽性；若產物為紫羅蘭色，則為不含單增李斯特菌的陰性；或者，將步驟(2)得到的LAMP反應產物進行進行電泳檢測，若擴增到梯度帶，則為單增李斯特菌陽性；若未擴增到任何條帶，則為不含單增李斯特菌的陰性。

8.根據權利要求7所述的檢測單增李斯特菌的方法，其特征在于：

步驟(2)中，PCR反應的體系采用25μL反應體系，包括1.5U無3′外切酶活性的taq酶，2.5μL 10Xtaq酶Buffer，0.2mM的dNTP，2mM MgCl₂，各0.2μM的引物F和引物R，2μL的DNA模板，再用ddH₂O補齊到25μL；

反應條件為，95℃預變性3min；循環反應為95℃變性15s，53℃退火30s，72℃延伸110s，30個循環；最后72℃延伸10min。

9.根據權利要求7所述的檢測單增李斯特菌的方法，其特征在于：

步驟(2)中，LAMP擴增體系共25μL，包括8U Bst DNA聚合酶，1×Bst DNA聚合酶緩沖液，F3和B3各0.2μM，FIP和BIP各1.6μM，dNTPs 1.6μM，甜菜堿0.8M，硫酸鎂8mM，模板DNA 2μL，HNB染料0.12mM，去離子水補齊；

LAMP反應條件為65℃擴增60min，隨后90℃滅酶2min。

10.根據權利要求7或8所述的檢測單增李斯特菌的方法，其特征在于：

步驟(2)中，利用權利要求3所述的用于檢測單增李斯特菌的試劑進行PCR反應時，步驟(3)中的目標條帶的長度為1653bp。