[發明專利]基于球形核酸的級聯信號放大高靈敏檢測外泌體

在審

• 申請號: 202110045497.9
• 申請日: 2021-01-13
• 公開（公告）號: CN112458152A
• 公開（公告）日: 2021-03-09
• 發明（設計）人: 李根喜;王磊;鄧穎
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C12Q1/682
• 分類號: C12Q1/682
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

由于外泌體與生理、病理過程的改變有緊密的聯系，因而，外泌體被視為一種很有前景的生物標志物。當前，高靈敏檢測外泌體依然是一個巨大的挑戰。我們提出了基于球形核酸(spherical nucleic acids，SNAs)級聯信號放大策略用于高靈敏檢測外泌體。在該方法中，引物鏈通過疏水作用力與外泌體膜結合形成SNAs。接著，SNAs可被脫氧核糖核酸末端轉移酶(TdT)聚合形成polyT鏈。polyT鏈作為模板在核酸外切酶III(Exo III)作用下不斷切割信號探針(探針A)。隨后，新的引物鏈和新的模板鏈不斷生成，并在雙酶的作用下消耗探針A，最后導致電化學信號劇烈降低。總之，該方法提供了一種簡單的基于SNAs的級聯信號放大策略用于高靈敏檢測外泌體并具有潛在的臨床診斷應用價值。

技術領域

本發明屬于分析化學領域，涉及基于球形核酸和酶介導的信號級聯放大檢測外泌體的原理，過程，實驗條件及應用。

發明背景

外泌體是一個裝載有蛋白、核酸以及小分子代謝物的膜結構復合體，其內容物組成及變化往往與組織細胞的生理狀態密切相關。腫瘤的發生、發展與轉移也影響外泌體上膜蛋白、膜內核酸變化。各種不同的細胞均能分泌外泌體并釋放到體液中，在全身循環。血液、尿液、唾液中均能發現外泌體的存在。外泌體作為液體活檢中一種有巨大潛力的腫瘤標志物，在疾病診斷、治療預后方面有重要的臨床價值。因此，準確、靈敏檢測外泌體對于進一步研究外泌體的功能以及臨床診斷具有重要意義。

由于外泌體在疾病診斷和預后中的重要作用，研究人員設計了許多方法用于外泌體的檢測分析，比如傳統的酶聯免疫吸附(ELISA)、免疫印跡 (western blotting)和納米粒子示蹤分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)。但這些方法一方面操作較為繁瑣，需要熟練的技術；另一方面所需的樣品量較大，且檢測的靈敏度較低。因此發展新的方法用于外泌體簡單、靈敏的檢測有利于促進外泌體的深入研究與臨床應用。當前，利用表面增強拉曼光譜、流式細胞術、微流控、電化學等方法能夠對外泌體進行較為靈敏的檢測分析。這些方法通常利用抗體或者適體作為特異性檢測探針與外泌體膜蛋白結合后用于信號放大。抗體價格較為昂貴且不穩定，需要放于-20℃低溫中保存；適體通常需要比較復雜的設計以降低背景信號或者響應靶標發生構象變化。這些方法中使用的抗體和適體可能增大外泌體檢測分析的成本和設計難度。為此，設計出一種比較通用型的高靈敏檢測外泌體的方法仍然具有挑戰。

球形核酸(Spherical nucleic acids，SNAs)是一種修飾在球形納米材料上的一層致密和高度定向的核酸。由于與互補核酸或者受體蛋白結合的親和力強，球形核酸越來越多地被用于生物監測和藥物遞送。外泌體是一種由磷脂雙分子層組成的球形或類球形囊泡，能夠與修飾膽固醇的分子通過疏水作用結合。受此啟發，外泌體能夠作為一個核心模板大量結合修飾膽固醇的核酸鏈以形成球形核酸。因此，我們對于外泌體的檢測可以轉換成對膜蛋白和膜脂的檢測。即利用膜蛋白適體特異性捕獲外泌體，接著疏水的磷脂雙分子層與修飾膽固醇的 DNA單鏈基于疏水作用力結合形成球形核酸，結合上外泌體的球形核酸則引發信號放大反應。由此，我們提出了一個外泌體膜上核酸結合、生長、切割的循環信號放大方法用于高靈敏檢測外泌體。

發明內容

本發明的目的是基于球形核酸的級聯信號放大用于高靈敏檢測外泌體。