[發明專利]一種兩步法培養人參果脫毒苗的方法

在審

• 申請號: 202110044779.7
• 申請日: 2021-01-13
• 公開（公告）號: CN112841028A
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 張麗芳;蔣瑜;李榮瓊;楊春利;張力;施林
• 申請（專利權）人: 昆明市農業科學研究院
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 昆明金科智誠知識產權代理事務所(普通合伙) 53216
• 代理人: 胡亞蘭

1.一種兩步法培養人參果脫毒苗的方法，其特征在于：包括以下步驟：

S1、無菌苗培養：

S1.1、外植體材料采集：于人參果的生育期，對準備進行脫毒復壯的品種進行田間株選，選擇具有該品種典型特性、生長健壯的單株，結合產量情況，選擇植株長勢好、高產、高抗、大果率高、無病斑的單株作為無菌苗培養的基礎材料，剪取枝條，做好相應的保鮮處理，帶回實驗室；

S1.2、外植體的處理和消毒：對采集回來的枝條進行剪切，取3cm～4cm長的頂芽、腋芽及枝條中部帶1～2個節的莖段，在流水下用軟毛刷輕輕逐個刷洗后放于燒杯中，用紗布封口，放于自來水下沖洗30min；然后，在超凈工作臺上用75％的酒精浸15s，無菌水沖洗2次，再用0.1％的升汞浸泡12min，浸泡時不間斷搖蕩瓶子，以確保外植體得到較為徹底的消毒，最后，用無菌水反復沖洗6次；

S1.3、離體培養：在超凈工作臺上，對經嚴格消毒過的頂芽、腋芽和莖段進行剪切，切掉被藥劑傷害的部分；剪切后的頂芽、腋芽和莖段接種至盛有PH值為5.8的無菌苗培養基：MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+食用白糖30g/L+瓊脂粉6.5g/L的培養容器中，培養于溫度22℃～25℃、相對濕度70％、光照強度2000Lux～3000Lux，光照時數12h/d的培養室中，培養3～4周；

S1.4、轉接：待步驟S1.3中所述頂芽、腋芽和莖段長成含4～5片葉子的小苗時，剪切成單節段，轉接至盛有PH值為5.8的無菌苗培養基：MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+食用白糖30g/L+瓊脂粉6.5g/L的培養容器中，培養成無菌苗；

S1.5、無菌苗熱處理：將無菌苗放置于37℃±1℃光照培養箱中，光照強度2000Lux，每天光照時間12h，處理10～14d，使部分病毒鈍化；

S2、莖尖脫毒與培養：

S2.1、莖尖剝離與接種：在超凈工作臺上，剪取經熱處理后無菌苗的莖尖，放置于解剖鏡的載物臺上，在莖尖下墊一張滅過菌的濕濾紙保濕，借助40X雙目解剖鏡，剝離莖尖直至露出半圓形光滑的生長點，用鋒利的無菌解剖針小心切取0.2mm～0.3mm帶1-2個葉原基的莖尖，迅速接種于盛有PH值為5.8的誘導培養基：MS+6-BA 0.05mg·L^-1+NAA 0.01mg·L^-1+GA₃0.1mg·L^-1+瓊脂6.5g·L^-1+食用白糖30g·L^-1的培養瓶中，每個培養瓶內接種一個莖尖；

S2.2、莖尖培養：接種好的莖尖放在培養室內培養，溫度22℃～25℃，光照2000lx～3000lx，每天光照12h；培養3～4周后，培養瓶內的莖尖生長點明顯變大變綠，30d-60d即可看到明顯伸長的小苗，葉原基形成可見的小葉；此時，將小苗轉入盛有PH值為5.8的誘導培養基：MS+6-BA 0.05mg·L^-1+NAA 0.01mg·L^-1+GA₃0.1mg·L^-1+瓊脂6.5g·L^-1+食用白糖30g·L^-1的培養瓶中培養，小苗繼續生長，并形成根系，30d左右即可長成完整的小植株。

2.根據權利要求1所述的兩步法培養人參果脫毒苗的方法，其特征在于：步驟S1.4中，待所述單節段長成含4片～5片葉子的小苗時，將所述小苗再次剪切成單節段，轉接于盛有無菌苗培養基：MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+食用白糖30g/L+瓊脂粉6.5g/L的培養容器中，重復1～2次，以增加無菌苗的數量。

3.根據權利要求1所述的兩步法培養人參果脫毒苗的方法，其特征在于：所述無菌苗培養基和誘導培養基在制備好后需分裝于培養容器中，蓋好蓋子，裝入高壓滅菌鍋中，在1.1kg/cm²、121℃條件下進行高壓滅菌25min～30min，冷卻后在潔凈貯存室放置3d～5d，無污染的無菌苗培養基和誘導培養基備用。

4.根據權利要求1所述的兩步法培養人參果脫毒苗的方法，其特征在于：由于超凈工作臺的氣流和酒精燈發出的熱都會導致莖尖迅速變干，因此，在莖尖剝離過程中應盡量縮短莖尖的暴露時間，每剝一個莖尖換一張無菌濕濾紙。