[發(fā)明專利]T7-RNA聚合酶突變體及其應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2021-01-13
• 公開（公告）號: CN112831484B
• 公開（公告）日: 2022-09-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 朱斌;吳慧
• 申請（專利權(quán)）人: 華中科技大學(xué)
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12P19/34;C12Q1/686
• 代理公司: 南京縱橫知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32224
• 代理人: 祝蓉蓉

本發(fā)明公開一種T7?RNA聚合酶突變體，這種突變體是將野生型T7?RNA聚合酶的氨基酸序列的從N端開始第43位的絲氨酸被A類氨基酸或B類氨基酸替代后得到的。A類氨基酸為酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸或天冬氨酸，B氨基酸為色氨酸、異亮氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸或脯氨酸。上述這種T7?RNA聚合酶突變體適合內(nèi)部含有終止信號的RNA以及末端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA的合成，在體外轉(zhuǎn)錄、RNA合成、基因編輯、RNA藥物合成、體內(nèi)蛋白質(zhì)表達或無細胞蛋白表達體外翻譯系統(tǒng)、轉(zhuǎn)錄終止子研究、RNA依賴的RNA聚合酶活性研究、生物學(xué)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件合成等方面均能具有廣泛應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于核酸工具酶與核酸生物領(lǐng)域，特別是噬箘體T7-RNA聚合酶突變體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

RNA(核糖核酸)作為遺傳信息傳遞的一類生物大分子，在真核生物、原核生物、部分病毒及類病毒中廣泛存在，并具有許多不同的種類及功能。除最初鑒定的三大類RNA：mRNA、rRNA以及tRNA外，后續(xù)發(fā)現(xiàn)的幾類新穎的RNA如microRNA(miRNA)(Cheng et al.,2005)、long non-coding RNA(lncRNA)(Dey et al.,2014)、Circular RNAs(circRNA)(Memczak et al.,2013)等也成為近年來RNA研究中的熱門領(lǐng)域。此外，RNA相關(guān)研究的逐漸深入揭示出RNA在疾病治療方面有著非常重要的應(yīng)用價值。體外合成的siRNA和mRNA可以成為RNA靶向治療的重要藥物(Sahin et al.,2014；Wittrup et al.,2015)，大型制藥公司如Merck、Shire等都致力于開發(fā)RNA藥物用于疾病治療。此外，體外合成的mRNA由于具有在體內(nèi)蛋白瞬時表達等優(yōu)點當前已被作為一類全新的疫苗——mRNA疫苗被推廣應(yīng)用(Pardi etal.,2018)。

隨著RNA相關(guān)研究和應(yīng)用的大量開展，對RNA合成提出了很高的挑戰(zhàn)。RNA體外合成包括化學(xué)合成和酶法合成兩種方法。化學(xué)合成法僅適用于合成幾十個核苷酸長度的RNA，由于長度的增加，生產(chǎn)成本會急劇上升。當核苷酸達到一百個以上時，化學(xué)合成法已不再適用，而編碼蛋白質(zhì)的mRNA通常含有幾千個核苷酸，因而酶法合成是當前制備長鏈RNA的唯一方法。來自短尾噬菌體編碼的單亞基RNA聚合酶由于具有結(jié)構(gòu)簡單、轉(zhuǎn)錄高效等優(yōu)點，被廣泛用于體外轉(zhuǎn)錄合成RNA，這是RNA相關(guān)研究的一類重要工具酶，其中以來源于大腸桿菌噬菌體T7的單亞基RNA聚合酶應(yīng)用最為廣泛。T7-RNA聚合酶于上世紀70年代被鑒定，在首次克隆后就廣泛用于RNA的體外合成、體內(nèi)蛋白表達(細菌高表達系統(tǒng))等(Davanloo et al.,1984)，此外近年來T7-RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)在合成生物學(xué)中也呈現(xiàn)出重要作用(Wang etal.,2018)。但是T7-RNA聚合酶除了轉(zhuǎn)錄高效、延伸能力強等優(yōu)點外，其作為體外RNA合成工具也存在一些不可忽略的缺點。它在合成RNA的過程中可能會產(chǎn)生許多的副產(chǎn)物，包括轉(zhuǎn)錄起始過程中產(chǎn)生的寡核苷酸、終止信號造成的中斷RNA產(chǎn)物、RdRp活性造成的3’末端延伸產(chǎn)物等(Katalin et al.,2011)。研究發(fā)現(xiàn)存在兩類終止信號造成T7-RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止，一類終止子是由于編碼的RNA形成明顯的莖環(huán)結(jié)構(gòu)而造成終止，二類終止子則是編碼的RNA含有共同序列(HAUCUGUU)而造成的一類特殊的序列特異性終止(Macdonald et al.,1994)。而T7-RNA聚合酶的RdRp活性造成的末端延伸產(chǎn)物則是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物的3’末端具有明顯二級結(jié)構(gòu)情況下(Nacheva and Berzal-Herranz,2010)。體外合成的RNA產(chǎn)物的不均一性會導(dǎo)致RNA藥物在遞送入脊椎動物體內(nèi)后先天性免疫的激活，這也是當前RNA靶向療法需解決的關(guān)鍵問題。雖然存在一些純化方法比如高效液相色譜(HPLC)能夠去除這種由于RNA產(chǎn)物不均一造成的免疫激活，但在大規(guī)模的生產(chǎn)合成中造成了生產(chǎn)成本的大量增加，純化流程的增多也不利于RNA藥物的穩(wěn)定性。因而當前開發(fā)新的RNA合成工具酶使其維持高效轉(zhuǎn)錄并同時降低RNA產(chǎn)物不均一性具有非常重要的應(yīng)用價值。