[發明專利]LDLR基因缺失斑馬魚的制備

在審

• 申請號: 202110043825.1
• 申請日: 2021-01-13
• 公開（公告）號: CN112813106A
• 公開（公告）日: 2021-05-18
• 發明（設計）人: 汪利平
• 申請（專利權）人: 汪利平
• 主分類號: C12N15/89
• 分類號: C12N15/89;C12N15/55;C12N15/12;A01K67/027;A01K61/10
• 代理公司: 暫無信息
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本發明利用CRISPR/Cas9技術，構建成了LDLR基因缺失斑馬魚，具體步驟包括：1)根據LDLR基因序列，確定LDLR靶位點；2)制備gRNA；3)體外轉錄Cas9mR NA；4)將Cas9mRNA和gRNA混合，注射到單細胞期斑馬魚胚胎中；5)將F₀胚胎飼養至性成熟；6)與野生型成魚外交，篩選F₀；7)選取可產生有效突變的F₀自交，篩選F₁；8)從F₁代突變體中挑選相同突變的雌魚和雄魚，雜交得到F₂代；9)篩選L DLR基因敲除純合子即為穩定遺傳的LDLR基因缺失斑馬魚。本發明構建的LDLR基因缺失斑馬魚可穩定遺傳，可用于血管栓塞的研究。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及LDLR基因缺失斑馬魚的制備。

背景技術

心血管疾病的死亡率極高，已成為人類疾病致死的第一重要原因，其中最主要的一個病理根本就是動脈粥樣硬化，是多種因素促成，一般是由大中動脈血管內壁免疫細胞浸潤，膽固醇、類脂肪等脂類物質在血管壁粘附，出現脂質條紋、脂核、鈣質沉著和纖維等組織增生，最后形成血腫破裂、大塊出血、血栓等，導致一系列的脂肪代謝紊亂、神經血管功能失調、官腔狹窄、動脈彈性減低等。

LDLR即是低密度脂蛋白受體，也是肝細胞表面受體之一，能夠結合Apoe，從而清除血中的脂蛋白顆粒，同時LDLR也能通過與LDL顆粒上的脂蛋白B相互作用，從而清除血中的LDL，LDLR對清除血液中膽固醇和甘油三酯富集的脂蛋白顆粒非常重要。

斑馬魚是除了大鼠和小鼠以外，第三大脊椎動物模型，斑馬魚體外受精、體外發育、胚胎透明、發育過程可視、一次產卵數量大，是研究心血管疾病良好的動物模型。

發明內容

本發明的目的是利用CRISPR/Cas9系統構建一種LDLR基因缺失斑馬魚。

本發明的制備過程如下：

本發明靶位點DNA序列為：5’-GGTAGCTGGAAGTGTGATGG-3’。

本發明提供一種基因打靶試劑盒，所述試劑盒包括兩條Oligo序列，其序列為5’-TAGGTAGCTGGAAGTGTGATGG-3’，5’-AAACCCATCACACTTCCAGCTA-3’，使用該試劑盒可以用于LDLR基因表達的沉默。

本發明提供了一種基因敲除方法，所述方法的步驟如下：利用所述的Oligo片段識別目的基因的靶位點，與Cas9結合并識別靶位點處PAM序列，引導核酸酶結合到目的基因靶位點處，并開始進行剪切，形成DSB缺口，隨后細胞通過非同源末端連接修復機制修復目的基因雙鏈，造成移碼突變，最終目的基因被敲除。

進一步的，所述靶點為一個或以上。

進一步的，本發明提供LDLR基因缺失斑馬魚的制備方法，所述制備方法包括：

1.根據LDLR基因序列，確定LDLR靶位點；

2.根據LDLR靶位點，設計Oligo序列；

3.構建gRNA體外轉錄載體；

4.PCR獲得gRNA體外轉錄模板；

5.對步驟4獲得的模板進行體外轉錄，得到gRNA；

6.制備Cas9 mRNA的體外轉錄模板；

7.體外轉錄Cas9 mRNA；

8.添加polyA序列、回收Cas9 mRNA；

9.將Cas9 mRNA和gRNA混合，注射到單細胞期斑馬魚胚胎中；

10.將F₀胚胎飼養至性成熟；