[發明專利]三重檢測副溶血弧菌的PCR引物組、試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 202110042999.6
• 申請日: 2021-01-13
• 公開（公告）號: CN112609014A
• 公開（公告）日: 2021-04-06
• 發明（設計）人: 許華;李貴陽;張慶利;黃倢;宋曉玲
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院黃海水產研究所
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/63
• 代理公司: 北京化育知識產權代理有限公司 11833
• 代理人: 尹均利

1.一種三重檢測副溶血弧菌的引物組，其特征在于，包含三對引物，分別是AHPND引物上下游引物對分別是SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2；Para引物上下游引物對分別是SEQ IDNO:3，SEQ ID NO:4；弧菌管家基因引物上下游引物對分別是SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6。

2.三重檢測副溶血弧菌的試劑盒，其特征在于，含有以下試劑：

A液:

PCR反應液含2xTaq PCR Mix 12.5uL、權利要求1所述的三對引物，其中引物對濃度均為10uM；

B液：ddH₂O100uL，作為陰性對照。

3.一種檢測副溶血弧菌三重PCR檢測方法，其特征在于，包括下列步驟：

(一)待測樣本的核酸提取

提取待測樣本的DNA，-20℃保存；

(二)PCR擴增反應體系

將10×PCR緩沖液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、檢測引物組以及步驟(一)提取的樣本DNA模板加入滅菌PCR反應管中，添加滅菌雙蒸水至總體積25μl，同時設置陽性、陰性對照，使用PCR儀進行擴增反應；

反應體系如下：

PCR總反應體系為25ul，其中Pre MIX 12.5ul，Vibrio-para-syrb-for3 1.2ul，Vibrio-para-syrb-rev3 1.2ul，Vibrio universe for 0.4ul，Vibrio universe rev0.4ul，Vibrio ahpnd for 1ul，Vibrio ahpnd rev 1ul，模板1ul，ddH2O 6.3ul；

擴增循環參數：94℃，1min；[94℃，10s；60℃,50s]35*；72℃，10min；在含Genefinder2％的瓊脂糖凝膠中電泳，110V，30分鐘，分析實驗結果。