[發(fā)明專利]一種生物制品的痕量DNA提取方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110042152.8
• 申請(qǐng)日: 2021-01-13
• 公開（公告）號(hào): CN112725412A
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 顧越星
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海睿玥實(shí)驗(yàn)器材有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6806
• 分類號(hào): C12Q1/6806
• 代理公司: 北京盛凡智榮知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11616
• 代理人: 孫鑫

一種生物制品的痕量DNA提取方法，包括四個(gè)步驟，步驟一：蛋白消化；步驟二：DNA結(jié)合；步驟三：DNA洗滌；步驟四：DNA洗脫。本發(fā)明在常規(guī)操作蛋白酶K消化流程后，采用蛋白促溶劑去除樣品中蛋白殘留，從而進(jìn)一步減少殘留蛋白導(dǎo)致的PCR抑制。采用旋轉(zhuǎn)混勻的方式實(shí)現(xiàn)DNA與磁珠結(jié)合，這種混勻是360度上下顛倒的旋轉(zhuǎn)混勻，不會(huì)有沉淀產(chǎn)生，可以提高磁珠與DNA的結(jié)合效率。在常規(guī)乙醇洗滌樣品后，增加了不含乙醇的洗滌液B的洗滌。洗滌液B可以溶解一些乙醇所不能溶解的PCR抑制成分，從而可以提高DNA的純度，減少PCR抑制的現(xiàn)象，同時(shí)，洗滌液B的殘留不會(huì)產(chǎn)生PCR抑制的現(xiàn)象，因此洗滌液B清洗后可以立即進(jìn)入DNA洗脫步驟，無需乙醇干燥的步驟。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物制品DNA提取方法技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種生物制品的痕量DNA提取方法。

背景技術(shù)

目前生物制品(如單抗藥物和CAR-T細(xì)胞治療的病毒提取液)的DNA(脫氧核糖核酸)提取主要以高結(jié)合力的超順磁性的磁珠(磁珠是采用納米技術(shù)對(duì)超順磁性納米顆粒的表面進(jìn)行改良和表面修飾后，制備成的超順磁性氧化硅納米磁珠)為基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)DNA的高速、無害提取與純化。提取時(shí)，磁珠能在離液鹽(如胍鹽)緩沖液的環(huán)境下，通過氧化硅微觀界面與DNA分子特異性地識(shí)別和高效結(jié)合，進(jìn)而在外加磁場的作用下，磁珠和緩沖液得以分離，吸附有DNA的磁珠再經(jīng)洗脫得以純化。現(xiàn)有的DNA的純化主要分為四個(gè)步驟。一：用消化液和蛋白酶K對(duì)樣品進(jìn)行裂解消化，將生物制品的DNA釋放到消化液中；二：在離液緩沖液(如胍鹽)的條件下將游離的DNA吸附到磁珠表面；三：利用洗滌液與乙醇洗去未被吸附的蛋白質(zhì)、鹽分等雜質(zhì)；第四：采用非離液鹽的緩沖液(如水)將被吸附的DNA從磁珠洗脫，進(jìn)而獲得高純度DNA溶液。

實(shí)際情況下，由于各個(gè)生物制品的純化工藝、成分和蛋白濃度不同，提取中，有些成分(比如殘留蛋白、化學(xué)試劑殘留成分、醇類、糖類和殘留細(xì)胞質(zhì)等)會(huì)被共純化出來，因此提取DNA溶液往往會(huì)出現(xiàn)DNA提取回收率低和PCR抑制的現(xiàn)象。DNA提取回收率低和PCR抑制的結(jié)果會(huì)導(dǎo)致熒光定量PCR反應(yīng)(聚合酶鏈反應(yīng))的Ct值(Cycle Threshold,即每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。)滯后或完全無擴(kuò)增信號(hào)，而數(shù)據(jù)解讀的結(jié)果是DNA定量減少了或無DNA存在，但是這與實(shí)際情況是不符的，這樣一來，諸如細(xì)胞表達(dá)的蛋白藥物、蛋白疫苗或細(xì)胞治療的病毒純化液存在宿主細(xì)胞DNA含量超標(biāo)的情況，而檢測結(jié)果顯示是宿主細(xì)胞DNA含量在正常范圍內(nèi)(產(chǎn)品其實(shí)是不合格的，檢測結(jié)果顯示是合格的，也就是假陰性)。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有生物制品DNA提取中，因技術(shù)所限存在的如背景所述弊端，本發(fā)明提供了能從生物制品中快速、高效提取殘留DNA，且提取的DNA能有效去除PCR抑制的成分，確保后續(xù)的熒光定量PCR方法對(duì)宿主細(xì)胞或提取組織細(xì)胞殘留DNA進(jìn)行定量準(zhǔn)確性的一種生物制品的痕量DNA提取方法。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：