[發明專利]枳抗寒基因PtrERF9在植物抗寒遺傳改良中的應用

有效

• 申請號: 202110040096.4
• 申請日: 2021-01-13
• 公開（公告）號: CN112898391B
• 公開（公告）日: 2021-09-24
• 發明（設計）人: 劉繼紅;張楊;王敏
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C12N15/29;C12N15/84;A01H5/00;A01H6/82;A01H6/78
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所(普通合伙) 42001
• 代理人: 龔瑩瑩

本發明屬于植物基因工程領域，公開了枳抗寒基因PtrERF9在植物抗寒遺傳改良中的應用，PtrERF9基因為一種從極抗寒枳（Poncirustrifoliata）中分離、克隆出的一個轉錄因子，其序列為SEQ ID NO.1所示。將該基因構建超表達和干涉載體，并通過農桿菌介導的遺傳轉化將其分別導入煙草、檸檬和枳中，獲得的轉基因植株經生物學功能驗證，表明本發明所克隆的PtrERF9基因具有提高植物抗寒性的功能。該基因的發現，為植物抗逆分子設計育種提供新的基因資源，為實施綠色農業、節水農業提供新的遺傳資源，該遺傳資源的開發利用有利于降低農業生產成本和實現環境友好。

技術領域

本發明屬于植物基因工程領域，具體涉及枳(Poncirustrifoliata)抗寒基因PtrERF9在植物抗寒遺傳改良中的應用，將該基因在植株中超表達，獲得的轉基因植物抗寒性明顯提高。

背景技術

低溫是影響一些重要經濟作物產量與分布的主要非生物脅迫之一。低溫會破壞植物細胞膜系統，影響葉綠素合成以及光合作用等過程，導致酶活性降低，活性氧水平升高，細胞代謝紊亂，嚴重時導致植株死亡(Chinnusamy et al.,2007)。而植株在長期的進化過程中，逐步形成了復雜而高效的脅迫應答機制，當植物受到外界環境變化刺激后，其體內就會通過一系列信號傳導過程，最終誘導植物相關防御和抗性基因的表達(Pankaj et al.,2016)。此外，在脅迫應答反應中，還會引起抗氧化劑防御系統的增強、以及一些代謝物質的改變，包括可溶性糖、脂肪酸、脯氨酸及甜菜堿等(Thomashow,1999)。

低溫應答基因主要分為兩類，一類是調控基因，可以調控信號傳導和基因表達，另一類是功能基因，其編碼產物在細胞內直接發揮保護作用(Wang et al.,2003；Zhu,2016)。轉錄因子作為一類調控基因，具有“承上啟下”的功能，其不僅能夠感知低溫信號，還可以與真核基因啟動子區域中的順式作用元件發生特異性相互作用，調控一些低溫響應基因的表達，提高植株抗寒性(Golldack et al.,2011；Nakashima et al.,2014)。因此，發現并利用轉錄因子是提高植物抗逆性的更加有效的途徑。

AP2/ERF類轉錄因子位于乙烯信號轉導途徑的下游，含有高度保守的AP2區域(Riec hmann et al.,2000)。該結構域由57個左右氨基酸組成，可形成1個α-螺旋和3個反平行鏈構成的β-折疊結構。ERF轉錄因子家族參與植物的生物脅迫和非生物脅迫的應答，是同植物抗逆應答密切相關的一類轉錄因子大家族。在低溫脅迫方面，過量表達煙草可以使植株提高對低溫脅迫的耐受能力，通過反義表達ERF2的番茄植株則降低了對低溫耐受力，同時噴施外源乙烯后上述番茄植株又恢復了對冷脅迫的耐受能力(Zhang et al.,2010)。煙草中 ERF1和ERF4，擬南芥中的ERF1、ERF5以及番茄中的LeERF4和一些抗寒基因的誘導表達相關(Song and Galbraith,2006)。但是在現有的技術上尚未見AP2/ERF類轉錄因子參與柑橘低溫響應。

柑橘是全球產量最大的水果，喜溫暖濕潤氣候，主要分布在南、北緯40°之間的氣候和土壤適宜熱帶和亞熱帶地區。作為多年生木本植物的柑橘常遭受低溫凍害，對柑橘產業造成巨大損失。因此，培育抗低溫凍害品種是柑橘育種的重要目標之一。而柑橘存在著多胚性、高度雜合、雄性不育等因素，很難用傳統的雜交方法獲得新的抗性品種。而枳為柑橘的近緣屬，極耐寒，在經完全的低溫馴化后可耐-26℃的低溫，被廣泛應用于柑橘品種的砧木，是發掘重要的柑橘抗寒基因的理想材料。因此，克隆枳抗寒有關基因是抗寒基因工程的關鍵和基礎。

發明內容

本發明目的在于提供了枳抗寒基因PtrERF9在控制植物抗寒性狀中的應用。將該基因在植物中超表達或沉默表達，可獲得抗寒能力增強或減弱的植株，所述基因對應的核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示，編碼的蛋白質序列為SEQ ID NO.2所示。

為了達到上述目的，本發明采取以下技術措施