[發明專利]一種重組SIRPα-TRAIL融合蛋白的構建方法及其應用

有效

• 申請號: 202110039448.4
• 申請日: 2021-01-12
• 公開（公告）號: CN112852854B
• 公開（公告）日: 2023-06-06
• 發明（設計）人: 金曉明;孔丹;劉宇;張磊;賀巖;李曉波;喬聰;劉興漢
• 申請（專利權）人: 哈爾濱醫科大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C07K19/00;A61K38/17;A61P35/00;C12R1/19
• 代理公司: 棗莊小度智慧知識產權代理事務所(普通合伙) 37282
• 代理人: 鄭素娟

1.一種重組SIRPα-TRAIL融合蛋白的構建方法，其特征在于，所述重組SIRPα-TRAIL融合蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:3所示；包括如下步驟：

步驟1.?SIRPα-TRAIL?融合蛋白序列設計，查找?TRAIL和?SIRPα功能序；

步驟2.?將獲得的基因片段融合；

步驟3.?構建帶有His標簽的pET28(+)-SIRPα-TRAIL的表達質粒；

步驟4.?SIRPα-TRAIL融合蛋白帶有his原核表達系統建立；

步驟5.?SIRPα-TRAIL融合蛋白in?BL21(DE3)擴大培養的生長曲線；

步驟6.?鑒定SIRPα-TRAIL融合蛋白?in?BL21(DE3)誘導成功；

步驟7.?SIRPα-TRAIL融合蛋白表達位置鑒定；

步驟8.?SIRPα-TRAIL融合蛋白包涵體的洗滌及溶解；

步驟9.?SIRPα-TRAIL融合蛋白的純化；

步驟10.?融合蛋白的復性除鹽；

步驟11.?冷凍干燥，得到?SIRPα-TRAIL?融合蛋白粉末；

步驟4中SIRPα-TRAIL融合蛋白帶有his原核表達系統建立，具體內容如下：

將提取的pET28(+)-SIRPα-TRAIL質粒轉化入BL21(DE3)大腸桿菌感受態細胞，轉化后的大腸桿菌劃線涂抹于固體培養基上，37℃過夜培養后，觀察轉化結果提示轉化成功；

步驟5中?SIRPα-TRAIL融合蛋白in?BL21(DE3)擴大培養的生長曲線，具體內容如下：

挑取上述固體培養基上的單一菌落，在20ml含KANA的液體培養基中培養6h活化菌種，將活化后的菌液按不同比例加入含KANA的液體培養基中，每隔2h，留取樣本，培養10h，用酶標儀測量不同時間點的樣品的OD值，繪制生長曲線，6?h為菌種的對數生長期；

步驟6中鑒定SIRPα-TRAIL融合蛋白?in?BL21(DE3)誘導成功，具體內容如下：

將菌種擴大培養，取誘導前后大腸桿菌樣品進行SDS-PAGE電泳，可見誘導后表達量明顯增加，證明融合蛋白表達誘導成功；

步驟7中SIRPα-TRAIL融合蛋白表達位置鑒定，具體內容如下：

將活化后的SIRPα-TRAIL?in?BL21(DE3)菌液取1mL，添加于100?mL?LB液體培養基中，培養12h，超聲破碎大腸桿菌，取碎菌離心后上清、沉淀樣品進行SDS-PAGE電泳，蛋白在沉淀中大量表達，而上清幾乎沒有表達，證明SIRPα-TRAIL為包涵體表達；

步驟8中SIRPα-TRAIL融合蛋白包涵體的洗滌及溶解，具體內容如下：

將包涵體蛋白變為有生物活性的蛋白，首先是溶解包涵體，先將包涵體蛋白以2?M尿素的緩沖液洗滌，盡可能洗滌除去在蛋白表達過程中包裹于包涵體外部的非目的性雜蛋白，然后利用8?M尿素變性液將其溶解，取溶解后樣品進行SDS-PAGE電泳，在SIRPα-TRAIL分子量處有蛋白表達，證明成功將包涵體表達變為可溶性表達；

步驟9中SIRPα-TRAIL融合蛋白的純化，具體內容如下：

利用Ni柱親和層析，將8?M尿素溶解后的包涵體樣品上樣，選用不同濃度咪唑緩沖液洗脫Ni層析柱，低濃度的咪唑緩沖液將非目的性雜蛋白洗脫下，高濃度的咪唑緩沖液將SIRPα-TRAIL融合蛋白洗脫下來，將洗脫下的樣品進行SDS-PAGE電泳，證明純化出較為純凈的SIRPα-TRAIL融合蛋白；

步驟10中融合蛋白的復性除鹽，具體內容如下：

將第一次Ni柱親和層析純化SIRPα-TRAIL融合蛋白加至G25層析柱中，加入緩沖液洗脫層析柱，將樣品復性并除去咪唑和尿素，得到濃縮的SIRPα-TRAIL融合蛋白樣品，將得到的樣品進行SDS-PAGE電泳，分子量36kDa處即為SIRPα-TRAIL融合蛋白；

步驟11中?冷凍干燥，具體內容如下：

將過完?G25?所得的融合蛋白冷凍干燥?36?小時后，得到?SIRPα-TRAIL?融合蛋白粉末。

2.一種重組SIRPα-TRAIL融合蛋白，其特征在于，所述重組SIRPα-TRAIL融合蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:3所示。