[發明專利]高產L-甲硫氨酸的基因工程菌及其構建與應用

有效

• 申請號: 202110038518.4
• 申請日: 2021-01-12
• 公開（公告）號: CN112779200B
• 公開（公告）日: 2022-07-08
• 發明（設計）人: 柳志強;蔣浩然;張博;沈臻陽;楊輝;鄭裕國
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N15/54;C12N15/90;C12N15/113;C12P13/12;C12R1/19
• 代理公司: 浙江千克知識產權代理有限公司 33246
• 代理人: 冷紅梅

本發明涉及高產L?甲硫氨酸的基因工程菌及其構建方法與應用。本發明改造了大腸桿菌的L?甲硫氨酸合成網絡，通過強化大腸桿菌L?甲硫氨酸合成途徑的一碳模塊中的metF和GCV，增強大腸桿菌對亞甲基四氫葉酸的利用能力；通過用來源于pTrc99A的Trc啟動子置換fliY、malY的原有啟動子，增強半胱氨酸/胱氨酸內運途徑和半胱氨酸利用途徑，解除大腸桿菌因半胱氨酸生成而產生的代謝抑制；通過敲除大腸桿菌本身的glyA和引入來源于Arthrobacter sp.FB24的glyA在質粒上過表達，解除了大腸本身絲氨酸羥甲基轉移酶的限制，最后得到含有質粒的高產菌，L?甲硫氨酸產量從2.8g/L提高到3.83g/L。

(一)技術領域

本發明涉及一種高產L-甲硫氨酸的基因工程菌及其構建方法，以及其在微生物發酵制備L-甲硫氨酸中的應用。

(二)背景技術

甲硫氨酸，又名蛋氨酸，英文名Methionine，全稱2-氨基-4-甲巰基丁酸。一種含硫的非極性α-氨基酸，與蘇氨酸、賴氨酸等同屬于天冬氨酸家族Ⅲ，是哺乳動物的必需氨基酸和生酮氨基酸。1922年由Mueller首次從酪蛋白中分離出來。甲硫氨酸在堅果、肉類及部分植物中大量存在，而動物和人體內卻不能自行，缺乏蛋氨酸會引起人類毒血癥、肌肉麻痹、精神分裂及發育不良。L-甲硫氨酸目前被廣泛應用于醫藥、食品、飼料等各個領域。

目前蛋氨酸的生產方法主要分為化學合成法、生物發酵法、酶法。蛋氨酸工業化生產方法主要以化學合成法為主，以甲硫醇與丙烯醛加成后經Strecker反應得到D，L型甲硫氨酸混合物。但由于其原料都是有毒物質，比如丙烯醛、甲硫醇、氨和氰化物等，且對環境污染嚴重，蛋氨酸的大規模化學生產受到了限制。而蛋氨酸的生物發酵方法與其他常規的發酵過程如乳酸發酵等有著本質差別。如乳酸發酵途徑中通常會產生能量，而蛋氨酸的合成卻需要能量。微生物如果過量合成蛋氨酸會消耗過多的能量，因此微生物僅能生產滿足自身需要的蛋氨酸。多年來，科學工作者一直探索利用微生物發酵法生產甲硫氨酸，但由于其合成途徑調控過于復雜引，目前還沒有適用于甲硫氨酸的工業生產菌株。

目前報道的蛋氨酸的工程菌株包括谷氨酸棒桿菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和百合棒桿菌。誘變篩選抗結構類似物菌株和營養缺陷型菌株是最常用的育種方法。Kumar等采用紫外和亞硝基胍誘變技術處理百合屬棒桿菌，篩選獲得M-128菌株，其甲硫氨酸產量可以達到2.3g/L。閔偉紅，程麗等通過抗結構類似物的篩選以及復合誘變和青霉素濃縮法篩選獲得12株賴氨酸和蘇氨酸雙重營養缺陷型突變株北京棒桿菌，其甲硫氨酸產量最高可以達到3.55g/L。這些傳統的改造方法機理難以闡明，工作量大。隨著基因技術的發展，開始通過對代謝途徑的分析，精準地對關鍵位點基因進行改造，來獲得高產菌株。Usuda等在大腸桿菌中過表達metA基因，敲除metJ，thrBC基因并弱化metK基因使蛋氨酸產量達到0.24g/L。Schneider等通過基因改造大腸桿菌硫代硫酸鈉鹽的轉硫酶的活性，并添加適當硫源的到蛋氨酸產量0.55g/L。

現今我國對蛋氨酸需求量很大，但國內蛋氨酸的生產能力有限，所需的蛋氨酸絕大部分依賴進口。因此通過基因改造得到高產菌株對蛋氨酸的生產對環境問題有很大的幫助，對蛋氨酸的工業化生產有極大的促進作用。

(三)發明內容

本發明目的本發明目的是高產L-甲硫氨酸的基因工程菌及其構建方法，以及其在微生物發酵制備L-甲硫氨酸中的應用。

本發明采用的技術方案是：

一種高產L-甲硫氨酸的基因工程菌，由如下方法構建：