[發明專利]用于治療中樞神經系統損傷的自體脂肪源干細胞的培養方法

在審

• 申請號: 202110036915.8
• 申請日: 2021-01-12
• 公開（公告）號: CN112831465A
• 公開（公告）日: 2021-05-25
• 發明（設計）人: 占震鋒;李慶靜
• 申請（專利權）人: 上海南濱江細胞生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A61P25/00
• 代理公司: 合肥正則元起專利代理事務所(普通合伙) 34160
• 代理人: 周衛

1.用于治療中樞神經系統損傷的自體脂肪源干細胞的培養方法，其特征在于，包括如下步驟：

第一步、脂肪采集，然后在無菌場所采集供者的脂肪，將得到脂肪進行處理，去除血管和纖維部分，然后進行絞碎處理，絞碎處理后用含體積分數0.1-1％慶大霉素的D-Hanks緩沖液沖洗，去除殘留血液，得到脂肪組織；

第二步、獲取和分離自體脂肪源干細胞：將脂肪組織與所取脂肪組織等體積的0.2％膠原酶磷酸緩沖液消化，在37℃溫度條件下均勻震蕩消化50-70min，再置于離心機中以1800-2000r/min的轉速離心6-10min；將底層細胞用pH值為7.2-7.4的D-Hanks平衡鹽液反復吹打，清洗干凈；清洗下來的液體經100目篩網過濾，將濾液以1000r/min離心5min，棄去上清液，獲得干細胞；

第三步、干細胞培養：將第二步得到的干細胞按1-2×10⁴/cm²接種于培養瓶，加入10mL含體積分數15％胎牛血清的干細胞培養液，置于37℃、CO₂含量為5％的培養箱中培養，4-5天后更換新的含體積分數15％胎牛血清的干細胞培養液，棄去非貼壁細胞，每3-4天更換含體積分數15％胎牛血清的干細胞培養液一次，待細胞生長達到80％融合，在培養瓶中加含體積分數0.25％胰酶-EDTA進行消化；將培養瓶放入37℃孵箱中5min，在倒置顯微鏡下觀察細胞，用手掌輕輕拍打培養瓶確保細胞及組織塊完全消化下來，每個培養瓶中加入含體積分數15％胎牛血清的干細胞培養液10mL，反復吹打，將培養瓶中的細胞清洗干凈，將清洗下來的細胞懸液移入50mL離心管中，在900-1000r/min的轉速條件下離心5min，離心結束后，棄上清，向離心管中加入30mL含體積分數15％胎牛血清的干細胞培養液吹打干凈混勻細胞，即得自體脂肪源干細胞。

2.進根據權利要求1所述的用于治療中樞神經系統損傷的自體脂肪源干細胞的培養方法，其特征在于，干細胞培養液通過如下步驟制備：

將1％L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1％丙酮酸鈉、0.01％β-巰基乙醇、0.001％LLIF、0.0001％bFGF、10％FBS和0.001％除菌液用低糖DMEM定容至100mL，用0.22μL的濾器過濾，0℃保存得到干細胞培養液，其中的百分含量均為占配置好的干細胞培養液的體積百分比。

3.用于治療中樞神經系統損傷的自體脂肪源干細胞的培養方法，其特征在于，除菌液通過如下步驟制備：

將霉素200U、鏈霉素200U、卡那霉素100μg、制霉菌素15μg和兩性霉素B5μg混合，用D-PBS定容至100mL，制得除菌液。