[發明專利]用于治療退行性關節炎的自體脂肪源干細胞的提取方法

在審

• 申請號: 202110035633.6
• 申請日: 2021-01-12
• 公開（公告）號: CN112795534A
• 公開（公告）日: 2021-05-14
• 發明（設計）人: 占震鋒;李慶靜
• 申請（專利權）人: 上海南濱江細胞生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A61P19/02;A61P29/00
• 代理公司: 合肥正則元起專利代理事務所(普通合伙) 34160
• 代理人: 周衛

本發明公開了治療退行性關節炎的自體脂肪源干細胞的提取方法，首先在無菌條件下將腹部皮下正常脂肪組織清除結締組織、小血管、脂肪滴、脂肪粒，得到脂肪小塊；進而將脂肪小塊在完全培養液中培養，經過胰蛋白酶消化、離心處理后得到脂肪源干細胞，最后將脂肪源干細胞于完全培養液和抗凋亡保護劑中進行傳代培養，其中抗凋亡保護劑不僅具有促進動物造血干細胞增殖、分化的功能，而且還在脂肪源干細胞培養過程中發揮抗凋亡保護作用，提高脂肪源干細胞的成活率以及后期誘導分化成功率，本發明采用組織塊培養法操作簡單，體外擴增能力強，增殖時間短，具有多向分化的潛能，通過誘導分化培育能夠成為軟骨細胞，有助于治療退行性關節炎。

技術領域

本發明屬于干細胞制備技術領域，具體地，涉及用于治療退行性關節炎的自體脂肪源干細胞的提取方法。

背景技術

退行性關節炎又稱骨關節炎、老年性關節炎、肥大性關節炎，主要癥狀為關節疼痛，常為休息痛，表現為休息后出現疼痛，活動片刻即緩解，但活動過多后，疼痛又加劇，另一癥狀是關節僵硬，常出現在早晨起床時或白天關節長時間保持一定體位后，檢查受累關節可見關節腫脹、壓痛，活動時有摩擦感或“咔嗒”聲，病情嚴重者可能有肌肉萎縮及關節畸形。

脂肪源干細胞是一類可以自我更新、繁殖的干細胞，具有一般干細胞的多向分化潛能和穩定的體外多代謝增值能力，不僅能夠在不同誘導因子的作用下分化成為脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞、肌肉細胞、神經細胞，而且還能分泌作用于成纖維細胞，促進分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原和纖連蛋白，促進膠原合成，可發揮抗炎、抗氧化、抗衰老、損傷修復等作用。

利用脂肪源干細胞進行體外培養能夠改善治療退行性關節炎，但是其提取困難，因此，提供一種快速高效的脂肪源干細胞的提取方法是目前需要解決的技術問題。

發明內容

本發明的目的在于提供用于治療退行性關節炎的自體脂肪源干細胞的提取方法。

本發明需要解決的技術問題為：

現有技術中，脂肪源干細胞提取多用胰酶消化，提取干細胞過程繁瑣，純度不高，影響干細胞后期的增殖分化甚至其誘導形成過程，因此提供一種干細胞純度高、提供方法簡單、細胞活性高的提取方法是目前需要解決的技術問題。

本發明的目的可以通過以下技術方案實現：

治療退行性關節炎的自體脂肪源干細胞的提取方法，包括以下步驟：

第一步、在無菌條件下，取腹部皮下正常脂肪組織，清除明顯的結締組織及肉眼可見的小血管，用PBS緩沖液清洗3-5遍脂肪組織，再將其置于PBS緩沖液中用滅菌眼科剪將脂肪組織進行剪碎處理，再用眼科剪小心剔除痙膜、脂肪滴和脂肪粒，得到脂肪小塊；

第二步、向無菌培養皿中加入1-3mL血清并將其搖晃鋪勻，將25-35塊第一步得到的脂肪小塊放入無菌培養皿中，保持脂肪小塊之間的間隔4-6mm，然后向無菌培養皿中加入3-4mL的完全培養液，靜置培養3-5min后，然后緩慢倒置培養皿，將倒置后的培養皿置于體積分數3-5％的CO₂培養箱中，100％濕度、37℃下溫育4h后，再次翻轉培養皿，加入2-4mL完全培養液，之后每2-3天更換一次培養液，培養一周以后刮除脂肪小塊；

第三步、當脂肪源性干細胞生長至鋪滿培養皿底部80-90％時，將培養皿轉移至超凈臺上，用酒精棉球將超凈臺擦拭二遍，倒出培養皿中的培養液，用PBS緩沖液清洗培養皿底部1-2次，將清洗后的廢液倒出，向培養皿中加入1-2mL的濃度2.5g/L胰蛋白酶消化液，于37℃下消化1-3min后，倒置于相差顯微鏡下觀察到細胞回縮、變圓、間隙增大時，立即加入完全培養液終止消化；