[發(fā)明專利]用于治療退行性關(guān)節(jié)炎的自體脂肪源干細(xì)胞的提取方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110035633.6
• 申請日: 2021-01-12
• 公開（公告）號: CN112795534A
• 公開（公告）日: 2021-05-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 占震鋒;李慶靜
• 申請（專利權(quán)）人: 上海南濱江細(xì)胞生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A61P19/02;A61P29/00
• 代理公司: 合肥正則元起專利代理事務(wù)所(普通合伙) 34160
• 代理人: 周衛(wèi)

本發(fā)明公開了治療退行性關(guān)節(jié)炎的自體脂肪源干細(xì)胞的提取方法，首先在無菌條件下將腹部皮下正常脂肪組織清除結(jié)締組織、小血管、脂肪滴、脂肪粒，得到脂肪小塊；進(jìn)而將脂肪小塊在完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)，經(jīng)過胰蛋白酶消化、離心處理后得到脂肪源干細(xì)胞，最后將脂肪源干細(xì)胞于完全培養(yǎng)液和抗凋亡保護(hù)劑中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，其中抗凋亡保護(hù)劑不僅具有促進(jìn)動物造血干細(xì)胞增殖、分化的功能，而且還在脂肪源干細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)揮抗凋亡保護(hù)作用，提高脂肪源干細(xì)胞的成活率以及后期誘導(dǎo)分化成功率，本發(fā)明采用組織塊培養(yǎng)法操作簡單，體外擴(kuò)增能力強(qiáng)，增殖時(shí)間短，具有多向分化的潛能，通過誘導(dǎo)分化培育能夠成為軟骨細(xì)胞，有助于治療退行性關(guān)節(jié)炎。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于干細(xì)胞制備技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及用于治療退行性關(guān)節(jié)炎的自體脂肪源干細(xì)胞的提取方法。

背景技術(shù)

退行性關(guān)節(jié)炎又稱骨關(guān)節(jié)炎、老年性關(guān)節(jié)炎、肥大性關(guān)節(jié)炎，主要癥狀為關(guān)節(jié)疼痛，常為休息痛，表現(xiàn)為休息后出現(xiàn)疼痛，活動片刻即緩解，但活動過多后，疼痛又加劇，另一癥狀是關(guān)節(jié)僵硬，常出現(xiàn)在早晨起床時(shí)或白天關(guān)節(jié)長時(shí)間保持一定體位后，檢查受累關(guān)節(jié)可見關(guān)節(jié)腫脹、壓痛，活動時(shí)有摩擦感或“咔嗒”聲，病情嚴(yán)重者可能有肌肉萎縮及關(guān)節(jié)畸形。

脂肪源干細(xì)胞是一類可以自我更新、繁殖的干細(xì)胞，具有一般干細(xì)胞的多向分化潛能和穩(wěn)定的體外多代謝增值能力，不僅能夠在不同誘導(dǎo)因子的作用下分化成為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞，而且還能分泌作用于成纖維細(xì)胞，促進(jìn)分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原和纖連蛋白，促進(jìn)膠原合成，可發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗衰老、損傷修復(fù)等作用。

利用脂肪源干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)能夠改善治療退行性關(guān)節(jié)炎，但是其提取困難，因此，提供一種快速高效的脂肪源干細(xì)胞的提取方法是目前需要解決的技術(shù)問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供用于治療退行性關(guān)節(jié)炎的自體脂肪源干細(xì)胞的提取方法。

本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題為：

現(xiàn)有技術(shù)中，脂肪源干細(xì)胞提取多用胰酶消化，提取干細(xì)胞過程繁瑣，純度不高，影響干細(xì)胞后期的增殖分化甚至其誘導(dǎo)形成過程，因此提供一種干細(xì)胞純度高、提供方法簡單、細(xì)胞活性高的提取方法是目前需要解決的技術(shù)問題。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

治療退行性關(guān)節(jié)炎的自體脂肪源干細(xì)胞的提取方法，包括以下步驟：

第一步、在無菌條件下，取腹部皮下正常脂肪組織，清除明顯的結(jié)締組織及肉眼可見的小血管，用PBS緩沖液清洗3-5遍脂肪組織，再將其置于PBS緩沖液中用滅菌眼科剪將脂肪組織進(jìn)行剪碎處理，再用眼科剪小心剔除痙膜、脂肪滴和脂肪粒，得到脂肪小塊；

第二步、向無菌培養(yǎng)皿中加入1-3mL血清并將其搖晃鋪勻，將25-35塊第一步得到的脂肪小塊放入無菌培養(yǎng)皿中，保持脂肪小塊之間的間隔4-6mm，然后向無菌培養(yǎng)皿中加入3-4mL的完全培養(yǎng)液，靜置培養(yǎng)3-5min后，然后緩慢倒置培養(yǎng)皿，將倒置后的培養(yǎng)皿置于體積分?jǐn)?shù)3-5％的CO₂培養(yǎng)箱中，100％濕度、37℃下溫育4h后，再次翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，加入2-4mL完全培養(yǎng)液，之后每2-3天更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)一周以后刮除脂肪小塊；

第三步、當(dāng)脂肪源性干細(xì)胞生長至鋪滿培養(yǎng)皿底部80-90％時(shí)，將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至超凈臺上，用酒精棉球?qū)⒊瑑襞_擦拭二遍，倒出培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，用PBS緩沖液清洗培養(yǎng)皿底部1-2次，將清洗后的廢液倒出，向培養(yǎng)皿中加入1-2mL的濃度2.5g/L胰蛋白酶消化液，于37℃下消化1-3min后，倒置于相差顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮、變圓、間隙增大時(shí)，立即加入完全培養(yǎng)液終止消化；