[發明專利]一種基于高密度熒光標記法的細胞微管膨脹顯微成像方法

在審

• 申請號: 202110029702.2
• 申請日: 2021-01-11
• 公開（公告）號: CN112881671A
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發明（設計）人: 宗慎飛;張思瑤;王著元;崔一平
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N33/533;G01N21/64
• 代理公司: 南京瑞弘專利商標事務所(普通合伙) 32249
• 代理人: 徐激波

1.一種基于高密度熒光標記法的細胞微管膨脹顯微成像方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)制備高密度微管熒光標記的細胞樣品；

(2)錨定：使用6-丙烯氨基乙酸琥珀酸酯對所述高密度微管熒光標記的細胞樣品中蛋白質進行錨定；

(3)凝膠化：將步驟(2)中獲得的錨定后的生物細胞置于冰面上，快速混合384μL凝膠單體溶液與8μL加速劑，再迅速混合8μL的引發劑并搖勻，快速加入到生物細胞的玻底皿中，再放入細胞培養箱中孵育1h形成凝膠；

(4)消化：將步驟(3)所得凝膠加入4.5mL消化緩沖液，錫紙封裝后置于搖床上過夜反應；

(5)膨脹：將步驟(4)獲得消化后的凝膠加入去離子水置于搖床上透析，每隔1h換一次去離子水，重復3-5次，直至膨脹至樣本體積不再變化；

(6)成像：在吸水膨脹后的凝膠樣品加入成像緩沖液后，置于超分辨顯微鏡下成像，得到基于高密度標記法的細胞微管膨脹顯微圖像。

2.如權利要求1所述的基于高密度熒光標記法的細胞微管膨脹顯微成像方法，其特征在于：步驟(1)中所述制備高密度微管熒光標記的細胞樣品，其包括如下步驟，

使用PBS緩沖液清洗細胞，使用0.01％的Triton X-100溶液對細胞進行透膜處理，反應時間為12-13分鐘；

使用PBS緩沖液清洗細胞，加入固定液對細胞進行固定，靜置20分鐘；

將細胞置于搖床上，使用PBS緩沖液清洗3次，每次5分鐘；

使用1mg/mL的NaBH₄溶液除去非特異性熒光，搖床反應7分鐘，然后使用PBS緩沖液清洗細胞；

使用山羊血清進行封閉，室溫下搖床反應60-90分鐘，再使用PBS緩沖液清洗細胞；

加入微管一抗，4℃過夜反應后將細胞置于搖床上，再使用PBS緩沖液清洗3次，每次5分鐘；

加入AlexaFluor488標記的二抗，搖床反應2小時以上，再使用PBS緩沖液清洗3次，每次5分鐘，得到高密度微管熒光標記的細胞樣品。

3.如權利要求1或2所述的基于高密度熒光標記法的細胞微管膨脹顯微成像方法，其特征在于：所述的凝膠單體溶液為0.38g/mL丙烯酸鈉溶液、0.5g/mL丙烯酰胺溶液、0.02g/mLN，N-二甲基丙烯酰胺溶液、0.292g/mL氯化鈉溶液、0.1mol/LPBS、去離子水按照體積比45：10：15：80：20：18配制而成。

4.如權利要求1或2所述的基于高密度熒光標記法的細胞微管膨脹顯微成像方法，其特征在于：所述成像緩沖液為10μL/mL巰基乙醇、50μg/mL葡萄糖氧化酶、50μg/mL過氧化氫酶、100mg/mL葡萄糖按照體積比45：10：15：80：20：18配制成，共計2mL。

5.如權利要求1或2所述的基于高密度熒光標記法的細胞微管膨脹顯微成像方法，其特征在于：所述的消化緩沖液為0.05mol/L Tris溶液、0.001mol/L EDTA溶液、0.5％TritonX-100、0.8mol/L guanidine HCl溶液按照體積比45：10：15：80：20：18混合得到初混液，取4.5mL初混液加入占所述初混液體積比1：1500的K蛋白酶混合而成。

6.如權利要求1或2所述的基于高密度熒光標記法的細胞微管膨脹顯微成像方法，其特征在于：所述的加速劑為質量比為10％的TEMED溶液；所述的引發劑為質量比為10％的APS溶液。

7.如權利要求1所述的基于高密度熒光標記法的細胞微管膨脹顯微成像方法，其特征在于：步驟(6)中，所述成像采用的激發光波長為488nm，收集495-575nm之間的熒光信號進行超分辨成像。

8.如權利要求7所述的基于高密度熒光標記法的細胞微管膨脹顯微成像方法，其特征在于：所述成像，其時間為60分鐘以內。