[發明專利]一種抗牙鲆彈狀病毒的單鏈抗體

有效

• 申請號: 202110026588.8
• 申請日: 2021-01-08
• 公開（公告）號: CN112608383B
• 公開（公告）日: 2022-06-21
• 發明（設計）人: 侯竹美
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C12N15/13;C12N15/70;G01N33/569
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

本發明公開了一種抗牙鲆彈狀病毒的單鏈抗體ScFv?rHRV及其制備方法和應用，以及編碼該單鏈抗體的基因、含有該基因的載體和宿主細胞等。該抗牙鲆彈狀病毒的單鏈抗體，是由抗體重鏈可變區和輕鏈可變區通過接頭肽連接而成，并可通過原核表達系統進行高效表達。單鏈抗體ScFv?rHRV的分子量約為28kD，能夠特異識別牙鲆彈狀病毒，可進一步用于該病毒的診斷、治療制劑的開發和抗原表位研究。

技術領域

本發明屬于生物工程領域，具體涉及一種抗牙鲆彈狀病毒的單鏈抗體及其制備方法和應用。

背景技術

牙鲆彈狀病毒(Hirame rhabdovirus，HIRRV)為單股負鏈RNA病毒，是彈狀病毒科粒外彈狀病毒屬新成員。HIRRV病毒粒子呈子彈狀，長約160～180nm，寬約60～80nm，具有彈狀病毒典型的形態學特征。1986年，HIRRV在日本兵庫縣的患病牙鲆和香魚魚苗中首次分離獲得，隨后陸續在中國、韓國等地發現了該病毒的存在。牙鲆彈狀病毒主要感染牙鲆、香魚，從幼魚到成魚均可被感染。感染魚表現為鰭、肌肉組織及內部器官出血，造血器官壞死。人工感染試驗發現，HIRRV對黑鯛、無備平鲉和虹鱒等海水魚類或降河洄游魚類也具有強烈致病性。目前，HIRRV已給全球海水養殖業造成了嚴重的經濟損失。

病毒的檢測方法主要有細胞學診斷技術、免疫學診斷技術、分子生物學診斷技術。單克隆抗體技術屬于免疫學診斷技術，在病毒的檢測方面得到了廣泛應用。但單克隆抗體技術具有抗體基因容易丟失、抗體蛋白無法改造、工作量大等自身的一些缺陷。噬菌體抗體庫逐漸成為一種重要的抗體制備技術，其原理是將抗體可變區基因與噬菌體衣殼蛋白基因連接，并表達在噬菌體表面，通過抗原對抗體庫進行多輪親和吸附，從中淘篩出所需的特異性抗體。PCR技術、噬菌體表面展示技術以及大腸桿菌重組表達技術促進了噬菌體抗體庫技術的發展。通過PCR技術可以克隆出全套免疫球蛋白可變區基因，通過噬菌體表面展示技術可以將重組的免疫球蛋白可變區展示在噬菌體的表面，通過大腸桿菌重組表達技術可以將獲得的特異性抗體進行重組、表達和大規模制備。因此，噬菌體抗體庫技術可在較短的時間內開發出大量基因工程抗體，從而得到廣泛應用。噬菌體抗體庫技術開發的單鏈抗體ScFv僅僅是完整抗體的1/6，其分子量小可減少抗體的免疫原性，同時又是具有完全抗體結合位點的最小抗體片段。噬菌體抗體庫技術的另一個優點是可以通過特異性抗體的基因序列，對蛋白質結構進行改造，從而設計出更優的改造抗體，通過基因工程技術可以對其進行大規模的生產。

本發明采用噬菌體抗體庫技術篩選了一種抗牙鲆彈狀病毒的單鏈抗體，并進一步對其進行了抗體結構改造，為牙鲆彈狀病毒診斷試劑開發、新型藥物研究和抗原表位鑒定等提供了基礎。

發明內容

本發明的目的是提供一種抗牙鲆彈狀病毒的單鏈抗體，從而彌補現有技術的不足。通過構建噬菌體展示單鏈抗體庫，“富集-洗脫-富集”的循環操作，從中篩選得到一種抗牙鲆彈狀病毒的單鏈抗體ScFv-HRV，并經進一步改造獲得優化的單鏈抗體ScFv-rHRV，構建了表達單鏈抗體的基因工程菌，從而為采用生物工程的方法大量制備該單鏈抗體提供了基礎。

本發明首先提供一種抗牙鲆彈狀病毒的單鏈抗體ScFv-HRV，其編碼蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO:1；

編碼上述蛋白的一種基因，其一種核苷酸序列為SEQ ID NO:2；

改造的單鏈抗體ScFv-rHRV的氨基酸序列為SEQ ID NO:3；

編碼上述改造蛋白的一種基因，其一種核苷酸序列為SEQ ID NO:4；

本發明還提供一種抗牙鲆彈狀病毒的單鏈抗體的制備方法，其制備步驟如下：

1)將抗牙鲆彈狀病毒的單鏈抗體基因插入表達載體中，構建成重組表達質粒；

2)將構建的重組表達質粒轉化宿主菌，構建重組基因工程菌，并進行單鏈抗體的重組表達；