[發(fā)明專利]O-GlcNAc糖基化修飾一步酶標記試劑盒及其應用

有效

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• 申請日: 2021-01-08
• 公開（公告）號: CN112851731B
• 公開（公告）日: 2023-01-13
• 發(fā)明（設計）人: 吳李鳴;易文;田銀平;林丙義
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學
• 主分類號: C07H19/10
• 分類號: C07H19/10;C07H1/00;G01N30/02;G01N30/72;G01N30/06;G01N30/08;G01N30/14;C12Q1/48
• 代理公司: 浙江千克知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33246
• 代理人: 冷紅梅

本發(fā)明涉及一種O?GlcNAc糖基化修飾的體外檢測試劑盒，所述試劑盒主要包括牛源糖基轉(zhuǎn)移酶突變體溶液，帶修飾糖供體水溶液，氯化錳水溶液，以及緩沖液。本發(fā)明試劑盒可以實現(xiàn)O?GlcNAc糖基化修飾的體外高效標記，質(zhì)譜(LC?MS/MS)檢測一步酶法富集純化得到的蛋白數(shù)比兩步化學酶法鑒定到的蛋白數(shù)增加約1倍；此外，試劑盒還可應用于結(jié)腸腫瘤樣品的組織學研究。

(一)技術(shù)領域

本發(fā)明涉及O-GlcNAc糖基化修飾一步酶標記試劑盒及其應用。

(二)背景技術(shù)

翻譯后修飾是哺乳動物區(qū)別于低等生物的一個重要因素。其中，糖基化修飾是一個非常復雜的化學生物過程。糖基化修飾的復雜性主要與兩方面有關：單糖的多樣和各個單糖鏈接的多樣性。目前，單糖分子至少有5個手性中心，高等真核生物中有9種基本的單糖，這些單糖模塊可以通過兩種(α或者β)構(gòu)型的糖苷鍵在不同位置進行鏈接。直鏈或分支型糖鏈還可以發(fā)生二級修飾，例如磷酸化、硫酸化或脂化。細胞糖基化修飾的研究被稱為糖組學(glycome)，包括細胞對核苷酸糖供體、糖蛋白或糖脂受體、糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶在時空上的調(diào)控。

通過氮原子和氧原子與多肽鏈接的糖聚合物分別被稱為N-聚糖(N-glycans)和O-聚糖(O-glycans)，此外還有糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定蛋白、糖胺聚糖(GAGs)和鞘糖脂等。早在六十年前研究者就發(fā)現(xiàn)，糖基化修飾的變化與細胞癌變相關。腫瘤細胞的糖基化修飾與正常細胞比有很多不同，例如乳腺癌病人的血液中唾液酸和巖藻糖修飾糖蛋白的表達量與癌癥進程相關。特異性出現(xiàn)在腫瘤細胞的糖基化修飾被稱為腫瘤相關糖抗原(TACAs)。

O-GlcNAc糖基化修飾是N-乙酰葡萄糖(GlcNAc)基團連接到蛋白絲氨酸/蘇氨酸側(cè)鏈羥基上的一種糖基化修飾。研究表明，O-GlcNAc糖基化修飾在干細胞分化、免疫細胞成熟、細胞代謝調(diào)控和神經(jīng)細胞發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用。目前，O-GlcNAc糖基化修飾的檢測手段主要包括抗體、凝集素、非天然糖代謝標記法和化學酶標記法。其中，抗體和凝集素檢測法存在明顯缺點，糖抗體很難制備且親和力低，大部分凝集素的識別缺乏嚴謹?shù)奶禺愋裕茈y實現(xiàn)特定糖基化修飾的檢測。代謝標記法是檢測O-GlcNAc糖基化修飾的一種有效手段。帶有化學反應基團的GlcNAc類似物培養(yǎng)細胞，通過細胞代謝途徑，修飾后的GlcNAc類似物會整合到細胞糖蛋白上，然后利用生物正交反應實現(xiàn)帶有化學反應基團糖基化修飾的捕獲和標記。不過，代謝標記法有兩個限制：1)GlcNAc類似物或者代謝前體會參與到多種糖復合物的生物合成途徑中，無法實現(xiàn)O-GlcNAc糖基化修飾的標記，2)代謝過程有多種糖基轉(zhuǎn)移酶參與，所以代謝標記無法實現(xiàn)特定糖鏈結(jié)構(gòu)的研究。此外，給與病人可代謝非天然單糖前體(除了2-deoxy-2-(¹⁸F)fluoro-D-glucose)存在安全隱患等問題。所以，代謝標記無法用于人體組織樣本糖基化修飾的研究。

化學酶標記法(chemoenzymatic glycan labeling)在一定程度上可以改善代謝標記法的一些缺點。重組糖基轉(zhuǎn)移酶以核苷酸糖為供體催化單糖類似物連接到細胞表面或者細胞裂解液的特定受體上。鏈接的單糖類似物帶有放射性標記或者特定化學反應基團——與特定標簽分子發(fā)生生物正交反應而被標記。酶對受體底物的特異性是實現(xiàn)特定糖鏈結(jié)構(gòu)標記的關鍵。牛源半乳糖轉(zhuǎn)移酶(GalT1)以UDP-[³H]半乳糖為供體將放射性標記的半乳糖轉(zhuǎn)移到淋巴細胞的GlcNAc殘基上，進而發(fā)現(xiàn)了一種主要在細胞質(zhì)和細胞核中存在的O-鏈接的GlcNAc糖基化修飾。Hsieh-Wilson課題組報道了以帶有化學標簽的核苷酸糖類似物代替放射性糖供體用于O-GlcNAc修飾蛋白的標記。首先，牛源糖基轉(zhuǎn)移酶突變體GalT1-Y289L以UDP-GalNAz為糖供體將帶疊氮基團的標簽分子(GalNAz)鏈接到O-GlcNAc修飾的復合物上。然后，利用點擊化學反應將帶有炔烴修飾的熒光基團或者親和(biotin)報告基團的連接到O-GlcNAc糖基化修飾上。但文獻報道第二步點擊化學反應效率低且重現(xiàn)性低。

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種O-GlcNAc糖基化修飾一步酶標記試劑盒及其應用。