[發(fā)明專利]一種畢赤酵母UGGT1的多克隆抗體

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110020699.8
• 申請(qǐng)日: 2021-01-08
• 公開（公告）號(hào): CN112375143A
• 公開（公告）日: 2021-02-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王楠;楊彩峰;李剛強(qiáng);郭文芳;彭華康;王夢(mèng)琪;劉德虎
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所
• 主分類號(hào): C07K16/14
• 分類號(hào): C07K16/14;G01N33/569;G01N33/68
• 代理公司: 北京誠(chéng)呈知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11883
• 代理人: 楊凌波

本發(fā)明公開了一種畢赤酵母UGGT1的多克隆抗體。本發(fā)明將畢赤酵母UGGT1基因片段克隆至大腸桿菌中，經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，得到畢赤酵母UGGT1重組蛋白，以該重組蛋白為抗原，進(jìn)行動(dòng)物免疫，獲得含有UGGT1抗體的抗血清，該抗血清能夠特異性的與酵母中的UGGT1蛋白結(jié)合。本發(fā)明提供的抗體可以應(yīng)用于定性或定量測(cè)定畢赤酵母的UGGT1蛋白。本發(fā)明制備的抗體效價(jià)高，專一性強(qiáng)，支持ELISA、Western?blot等多種類型的實(shí)驗(yàn)操作。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程抗體技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種畢赤酵母UGGT1的多克隆抗體。

背景技術(shù)

UGGT1定位于真核生物的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Endoplasmic reticulum，ER），是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能夠識(shí)別糖蛋白折疊狀態(tài)的元件，在真核生物的糖蛋白質(zhì)量監(jiān)控系統(tǒng)中發(fā)揮核心作用。由于其重要的生物學(xué)功能，UGGT1一直是真核生物糖蛋白合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝等研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。近年來，隨著免疫生物技術(shù)的發(fā)展，ELISA、 Western-blot、Co-IP、IF等已成為蛋白質(zhì)研究的常規(guī)方法，不同物種來源的UGGT1抗體也應(yīng)運(yùn)而生，但由于這些抗體的抗原UGGT1的氨基酸序列差異較大，不同物種來源的UGGT1抗體并不能通用。目前，商品化的UGGT1抗體主要是以動(dòng)物和植物的UGGT1為抗原制備的，而可以結(jié)合酵母UGGT1的抗體仍處于市場(chǎng)空白，也未見有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。

畢赤酵母是重要的工業(yè)微生物，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料等領(lǐng)域的外源蛋白生產(chǎn)。其作為外源蛋白表達(dá)宿主，具有真核生物特有的翻譯后修飾功能、可以用廉價(jià)的無機(jī)鹽作為培養(yǎng)基進(jìn)行高密度發(fā)酵、細(xì)胞本身對(duì)人畜無毒害作用等諸多優(yōu)點(diǎn)。但畢赤酵母作為重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)，仍有一些瓶頸問題有待突破，例如不同的外源蛋白表達(dá)量差異巨大，一些蛋白的表達(dá)量可以達(dá)到每升發(fā)酵液克級(jí)以上，而有些蛋白的表達(dá)量卻低至微克級(jí)甚至無法檢測(cè)到；另外，畢赤酵母表達(dá)糖蛋白時(shí)，也容易發(fā)生過度糖基化，導(dǎo)致重組糖蛋白的功能和性質(zhì)發(fā)生改變，這些問題都源于目前對(duì)畢赤酵母細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成和代謝機(jī)制的研究還不夠透徹和全面。

另外，畢赤酵母也是重要的真核模式生物，它是具有真核生物特征的單細(xì)胞生物，是研究其他高等真核生物的優(yōu)良材料。其糖蛋白質(zhì)代謝途徑的詳細(xì)解析，不僅有利于解決上述其作為工業(yè)微生物遇到的問題，也有利于闡釋其他高等真核生物的糖蛋白質(zhì)合成和代謝機(jī)制。

在真核生物中，大多數(shù)蛋白質(zhì)需要經(jīng)過翻譯后修飾，如N-糖基化，O-糖基化、乙酰化以及形成二硫鍵等，才能發(fā)揮特定的生物學(xué)功能。其中N-糖基化是最普遍，也是最重要的翻譯后修飾方式之一。大量研究表明，N-糖基化對(duì)蛋白質(zhì)的生物活性、熱穩(wěn)定性、信號(hào)識(shí)別以及胞外釋放等均有顯著的影響。在各種真核細(xì)胞中，蛋白質(zhì)的糖基化有一套完整且保守的分子機(jī)制，這一過程主要包括（1）新合成的多肽進(jìn)入ER后，寡糖鏈Glc3Man9GlcNAc2在Oligosaccharide transferase（OST）的作用下，特異性的結(jié)合到新合成多肽的N-糖基化結(jié)合位點(diǎn)（Asn-Xxx-Ser/Thr，Xxx不能為Pro）的Asn上，（2）糖蛋白所結(jié)合的寡糖分子的末端三個(gè)葡糖糖會(huì)在葡萄糖苷酶Ⅰ和葡萄糖苷酶Ⅱ的作用下被依次迅速切掉，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜定位分子伴侶Calnexin（CNX）或可溶性分子伴侶Calreticulin（CRT）會(huì)特異性的與寡糖末端只帶有1個(gè)葡萄糖的糖蛋白可逆的相互作用，同時(shí)在其它分子伴侶（如二硫鍵異構(gòu)酶ERp57、肽基脯氨酰異構(gòu)酶CypB等）的幫助下進(jìn)行蛋白折疊，（3）如果此時(shí)糖蛋白能夠順利完成正確折疊，它將被轉(zhuǎn)運(yùn)出ER，進(jìn)入后續(xù)的加工步驟，最終被運(yùn)輸?shù)教囟ǖ募?xì)胞器或被分泌到胞外；如果糖蛋白不能完成正確折疊，位于ER中的UGGT1將識(shí)別錯(cuò)折疊糖蛋白，并重新在寡糖鏈上加上1分子葡萄糖，形成GlcMan9GlcNAc2，并重新被分子伴侶CNX/CRT 識(shí)別，形成CNX/CRT循環(huán)。在循環(huán)過程中，始終無法形成正確折疊的蛋白質(zhì)最終將進(jìn)入降解途徑。這一過程也被稱作ER相關(guān)的糖蛋白質(zhì)量監(jiān)控系統(tǒng)。在上述糖蛋白的加工過程中，UGGT1是唯一能夠識(shí)別糖蛋白折疊狀態(tài)的元件，是該過程的核心和限速元件。由于UGGT1的關(guān)鍵作用，有關(guān)UGGT1的研究始終是真核生物蛋白質(zhì)糖基化研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。