[發明專利]一種α-L-鼠李糖苷酶、其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202110019047.2
• 申請日: 2021-01-07
• 公開（公告）號: CN113584000A
• 公開（公告）日: 2021-11-02
• 發明（設計）人: 袁其朋;程磊雨;魏斌
• 申請（專利權）人: 北京化工大學
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/56;C12N15/81;C12N1/19;C12P33/20;C12P33/06;C12R1/645;C12R1/84
• 代理公司: 北京國林貿知識產權代理有限公司 11001
• 代理人: 李瑾;李連生

本發明公開了一種α?L?鼠李糖苷酶、其制備方法和應用，屬于基因工程和生物催化領域。具體涉及一種新型α?L?鼠李糖苷酶氨基酸序列和編碼基因、含有上述基因的重組載體和重組微生物、利用上述重組微生物發酵制備α?L?鼠李糖苷酶的方法以及所述α?L?鼠李糖苷酶在水解薯蕷皂苷制備薯蕷皂素中的應用。本發明提供的α?L?鼠李糖苷酶可以特異性水解植物黃姜中甾體皂苷C₃位置外側α?L?1,2?鼠李糖苷鍵，具有催化效率高、熱穩定性好、糖耐受性高等優點。此外，在所述α?L?鼠李糖苷酶和β?D?葡萄糖苷酶的共催化下，黃姜粗提物中的甾體皂苷幾乎完全轉化為薯蕷皂素，轉化率高達98.5%，表明其在規模化皂素生產中具有良好的應用前景。

技術領域

本發明屬于基因工程和生物轉化領域，具體涉及一種α-L-鼠李糖苷酶、其制備方法及應用。

背景技術

鼠李糖苷酶屬于水解酶大類，廣泛存在于動物、植物以及微生物中，可用于水解α-1,2、α-1,3、α-1,4以及α-1,6等連接的鼠李糖苷鍵，在食品、醫藥以及化工行業有重要的應用潛力，其中高熱穩定性、高催化效率以及高糖耐受性的酶對于工業酶催化應用至關重要。

盾葉薯蕷（Dioscores zingiberensis C.H. Wright，簡寫DZW），又名黃姜，可直接入藥，具有清熱解毒等功效。薯蕷皂素（Diosgenin）是黃姜中的重要活性成分，具有眾多藥理活性，如抗腫瘤、抗炎等。此外，薯蕷皂素更是甾體藥物合成的重要前體，被譽為“藥用黃金”和“激素之母”，市場應用前景廣闊。但皂素在天然植物中主要以皂苷形式存在，游離皂素含量極少。

傳統皂素生產工藝主要涉及皂苷的化學酸解，但大量高色度、高酸度以及高COD的廢水的產生對生態環境污染嚴重。隨著各國環保政策的收緊，大量中小皂素生產企業由于巨大的環保壓力而被迫停產，制約了皂素產業的發展。

近些年來，生物轉化已被廣泛應用天然藥物開發領域，如稀有天然化合物的制備以及新藥的發現等。皂素的生物制備具有條件溫和、污染小、成本低、副產物少等優點而被受關注。目前已有米曲霉、煙曲霉以及青霉等微生物被陸續報道用來轉化薯蕷皂苷制備皂素，但轉化效率低、周期長、規模生產潛力不足（中國專利申請公開號：107177662A、101012474B、103146795A等）。

此外，使用來源于米曲霉的鼠李糖苷酶以及新月彎胞霉的葡萄淀粉酶酶等催化水解甾體皂苷也被報道。但是現有的酶存在熱穩定性差、活性低以及糖耐受性低等缺點，限制了皂素的規模酶法生產（中國專利申請公開號：105925559A、101857855B等）。

現有報道的甾體皂苷水解酶在活性、穩定性以及耐糖性方面均顯不足，難以應用于皂素的工業化生產。因此，高活性、高穩定性、高耐糖性的新型糖苷酶是實現薯蕷皂素高效酶催化制備的關鍵。

發明內容

本發明的目的在于提供了一種高活性、高穩定性、高耐糖性的新型α-L-鼠李糖苷酶，所述糖苷酶氨基酸序列和編碼所述氨基酸序列的核苷酸序列、用于表達所述糖苷酶的表達載體、包含或整合所述表達載體的宿主細胞、以及上述α-L-鼠李糖苷酶在薯蕷皂素生產中的應用。

為實現上述發明目的，本發明提供了以下技術方案：

一種α-L-鼠李糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或為將SEQ ID NO.1經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加而形成的有α--L-鼠李糖苷酶活性的蛋白質，優選為與SEQ ID NO.1有60%以上的相似度。更優選為80%或90%以上。