[發(fā)明專利]一種檢測乙酰半胱氨酸中細(xì)菌內(nèi)毒素的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202110018811.4
• 申請日: 2021-01-07
• 公開（公告）號: CN112881699A
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 池浩超;張翼
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州浙中醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: G01N33/579
• 分類號: G01N33/579
• 代理公司: 北京盛凡智榮知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11616
• 代理人: 孫娜

本發(fā)明涉及一種檢測乙酰半胱氨酸中細(xì)菌內(nèi)毒素的方法，它包括以下步驟：將乙酰半胱氨酸用氫氧化鈉溶液(濃度為0.5?1.2mol/L)溶解混勻，使混合溶液中供試品乙酰半胱氨酸的濃度為0.08?0.12g/ml；在不超過最大有效稀釋倍數(shù)的情況下對乙酰半胱氨酸氫氧化鈉溶液進(jìn)行稀釋，制成供試品溶液；再采用凝膠法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。采用本發(fā)明的檢測方法可以消除乙酰半胱氨酸對細(xì)菌內(nèi)毒素的干擾作用，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠、操作簡便，檢測成本低，相對于熱源法，操作方便、經(jīng)濟、重現(xiàn)性好。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于藥物分析領(lǐng)域，具體涉及一種檢測乙酰半胱氨酸中細(xì)菌內(nèi)毒素的方法。

背景技術(shù)

細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁成分，當(dāng)細(xì)菌死亡或自溶后便會釋放出內(nèi)毒素。因此，細(xì)菌內(nèi)毒素廣泛存在于自然界中。當(dāng)內(nèi)毒素通過消化道進(jìn)入人體時并不產(chǎn)生危害，但內(nèi)毒素通過注射等方式進(jìn)入血液時則會引起不同的疾病。內(nèi)毒素小量入血后被肝臟細(xì)胞滅活，不造成機體損害，內(nèi)毒素大量進(jìn)入血液就會引起發(fā)熱反應(yīng)——“熱原反應(yīng)”，甚至導(dǎo)致死亡。因此，生物制品類、注射用藥劑、化學(xué)藥品類、放射性藥物、抗生素類、疫苗類、透析液等制劑以及醫(yī)療器材類(如一次性注射器，植入性生物材料)必須經(jīng)過細(xì)菌內(nèi)毒素檢測試驗合格后才能使用。制劑中的細(xì)菌內(nèi)毒素，最大來源為生產(chǎn)用原輔料，因此，生產(chǎn)制劑的原輔料的內(nèi)毒素水平同樣需要監(jiān)控。乙酰半胱氨酸為白色或類白色結(jié)晶性粉末；有類似蒜的臭氣；有引濕性。用于制劑生產(chǎn)的乙酰半胱氨酸，也需要進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測。

目前，細(xì)菌內(nèi)毒素檢測主要有兩種方法，分別為：凝膠法和光度法。凝膠法操作簡單，普及程度高，試驗條件要求低(37±1℃，60±2分鐘)。而光度法，操作相對復(fù)雜，普及程度低，試驗需要酶標(biāo)儀等專業(yè)的設(shè)備。凝膠法因上述優(yōu)勢，被各國藥典選擇作為仲裁試驗的方法(當(dāng)內(nèi)毒素檢測結(jié)果出現(xiàn)爭議時，以凝膠法結(jié)果為準(zhǔn))。

目前，乙酰半胱氨酸因為結(jié)構(gòu)式中有巰基(-SH)的存在，能破壞鱟試劑中的凝固酶原、凝固蛋白原，引發(fā)細(xì)菌內(nèi)毒素反應(yīng)的抑制作用，即便樣品中含有細(xì)菌內(nèi)毒素，也會因為樣品對細(xì)菌內(nèi)毒素檢測的抑制作用，而使檢測結(jié)果呈現(xiàn)“假陰性”。市面上采用的方法主要為：熱源法檢測。而熱源法存在重現(xiàn)性、靈敏度差；實驗動物的飼養(yǎng)，費用高，時間長；愛護動物方面；干擾因素多等缺點，不適宜大量采用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，提供一種凝膠法檢測乙酰半胱氨酸中細(xì)菌內(nèi)毒素的方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

包括以下步驟：1.將乙酰半胱氨酸用0.5～1.5mol/L氫氧化鈉溶解為0.08～0.12g/ml濃度工作母液，在不超過最大有效稀釋倍數(shù)的情況下對乙酰半胱氨酸氫氧化鈉溶液進(jìn)行稀釋，制成供試品溶液；再采用凝膠法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。本發(fā)明以細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解或稀釋乙酰半胱氨酸制備體積濃度為10％乙酰半胱氨酸。氫氧化鈉溶液也采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水進(jìn)行配置。在制備供試品溶液時，對乙酰半胱氨酸和氫氧化鈉的混合溶液采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水進(jìn)行稀釋，在不超過最大有效稀釋倍數(shù)的情況下，按照《2020藥典細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法》，進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

在一種優(yōu)選方案中，在不超過最大有效稀釋倍數(shù)的情況下，先以各稀釋倍數(shù)的供試品溶液進(jìn)行干擾實驗，找出無干擾情況下的最小稀釋倍數(shù)，再以該最小稀釋倍數(shù)稀釋制成的供試品溶液進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

在本發(fā)明中，根據(jù)待測乙酰半胱氨酸的細(xì)菌內(nèi)毒素限值和鱟試劑的靈敏度確定最大有效稀釋倍數(shù)，例如：乙酰半胱氨酸細(xì)菌內(nèi)毒素限值為0.5Eu/mg；鱟試劑的靈敏度為0.25Eu/ml；可以確定其最大有效稀釋倍數(shù)為200倍。