[發明專利]羅非魚精密肝切片損傷模型及其構建方法

在審

• 申請號: 202110016663.2
• 申請日: 2021-01-07
• 公開（公告）號: CN112680401A
• 公開（公告）日: 2021-04-20
• 發明（設計）人: 曹麗萍;賈睿;杜金梁;丁煒東
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院淡水漁業研究中心
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 余俊杰

本發明公開了羅非魚精密肝切片損傷模型及其構建方法，所述方法采用環磷酰胺誘導羅非魚精密肝切片，環磷酰胺的濃度在25mM以內。與現有技術相比，本發明具有以下優點：(1)本發明首次采用環磷酰胺誘導羅非魚精密肝切片構建損傷模型，為研究魚類肝損傷機制及保肝藥物的篩選和開發提供基礎；(2)所述方法的誘導對象采用羅非魚精密肝切片，其最大限度的模擬了在體狀態，是更為可靠的研究肝臟代謝和體外誘導毒性的模型體系。

技術領域

本發明屬于水產養殖技術領域，涉及一種肝臟切片的制備，具體為羅非魚精密肝切片損傷模型及其構建方法。

背景技術

隨著集約化養殖程度的不斷提高，以及養殖密度的加大，導致養殖環境日趨惡化；同時抗生素和殺蟲劑的濫用也造成魚類病害頻發，尤其是肝臟疾病。肝臟是魚類物質和能量代謝的重要器官，也是機體重要屏障器官，其解毒和吞噬功能對機體有重要保護作用。肝損傷或病變往往導致魚類機體代謝機能紊亂和抗病力降低，極易造成繼發傳染性疾病的爆發。因此，研究羅非魚肝損傷的發病機制，研發保肝藥物對于魚類的肝保護有十分重要的意義。

臨床上為了研究肝病的發病機制及藥物作用機理，建立了實驗性的肝損傷動物模型，利用這些具有生物學活性的肝損傷模型，可以快速而高通量地篩選護肝藥物。然而在魚類中，關于肝損傷模型研究還比較少，因此嚴重制約魚類肝損傷機制以及保肝藥物的篩選和開發。精密肝切片(precision-cut 1iver slice)技術是近幾年興起的一項研究肝組織體外代謝的方法。該技術保證了肝切片厚度、形狀和大小一致，能有效降低切片損傷程度；精密肝切片的代謝與肝臟組織更吻合，能最大限度地模擬在體狀態。精密肝切片的肝損傷模型是更為可靠的研究肝臟代謝及體外誘導毒性的模型體系。

環磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)經肝細胞色素CYP450酶系代謝，生成了具有活性的代謝產物--磷酰胺氮芥、丙烯醛及氯乙醛。它們與DNA等生物大分子產生共價結合后，導致機體抗氧化防御體系的抗氧化能力下降，大量自由基形成，最終造成氧化應激性肝損傷。 CTX誘導的肝損傷模型在臨床上有著廣泛的應用和研究，但是在羅非魚精密肝切片損傷模型沒有相關的報道。

發明內容

解決的技術問題：為了克服現有技術的不足，獲得一種通過環磷酰胺誘導羅非魚肝切片損傷模型的方法，本發明提供了羅非魚精密肝切片損傷模型及其構建方法。

技術方案：羅非魚精密肝切片損傷模型的構建方法，所述方法采用環磷酰胺誘導羅非魚精密肝切片，環磷酰胺的濃度在25mM以內。

優選的，環磷酰胺的濃度為20mM。

優選的，所述羅非魚精密肝切片由以下方法制得：將羅非魚飼養于循環水系統中，隨機抽取并采用麻醉放血處死，消毒后置于無菌狀態中取肝臟，肝臟置于以氧飽和、pH為7.4的冰Krebs-Henseleit(克-亨氏液)緩沖液中，去除包膜及凝血，采用解剖刀處理為組織塊并包埋入2.5％低熔點膠內；組織包埋物冷凝后置于含緩沖液的標本槽內切片。

優選的，羅非魚體重為150±5g。

優選的，羅非魚的飼養條件為27±2℃，pH6.8-7.6，DO5mg/L，NH₃0.05mg/L，H₂S0.01 mg/L；每天投喂量為魚體質量的2％。

優選的，切片的厚度為300μm，且切片過程持續通氧。

優選的，精密肝切片后續的培養條件如下：將肝切片置于48孔板中、5片/孔，每孔加入 500μl L-15培養基，培養基中含1％S/P(青鏈霉素)，0.2％heparin(肝素)和5％FCS(小牛血清)，27℃、120次/分水平振蕩培養。

優選的，環磷酰胺誘導羅非魚精密肝切片的具體步驟為：肝切片經L-15培養基預培2h 后移除上清液，向其中加入含有環磷酰胺的L-15培養基繼續培養，500μl/孔、27℃培養6h。