[發明專利]羅非魚體外免疫抑制模型及其構建方法

在審

• 申請號: 202110016639.9
• 申請日: 2021-01-07
• 公開（公告）號: CN112680416A
• 公開（公告）日: 2021-04-20
• 發明（設計）人: 曹麗萍;杜金梁;賈睿;丁煒東
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院淡水漁業研究中心
• 主分類號: C12N5/0786
• 分類號: C12N5/0786;C12N5/078
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 余俊杰

1.羅非魚體外免疫抑制模型的構建方法，其特征在于，所述方法采用環磷酰胺誘導羅非魚體外免疫細胞，環磷酰胺的濃度在50mM以內。

2.根據權利要求1所述的羅非魚體外免疫抑制模型的構建方法，其特征在于，環磷酰胺的濃度為40mM。

3.根據權利要求1所述的羅非魚體外免疫抑制模型的構建方法，其特征在于，所述方法具體為：分離羅非魚的免疫細胞后預培，然后移除培養上清，換用含環磷酰胺的L-15培養基繼續培養，棄上清測定免疫細胞的增殖活性，并同時測定部分免疫細胞中的一氧化氮和超氧陰離子含量。

4.根據權利要求3所述的羅非魚體外免疫抑制模型的構建方法，其特征在于，所述免疫細胞為頭腎巨噬細胞、外周血白細胞和脾細胞；其中所述的部分免疫細胞為頭腎巨噬細胞和脾細胞。

5.根據權利要求4所述的羅非魚體外免疫抑制模型的構建方法，其特征在于，頭腎巨噬細胞的分離方法如下：隨機抽取羅非魚，MS-222麻醉后，采血，在無菌的條件下，剖取羅非魚頭腎，并研磨，研磨液通過100目尼龍網，濾過液加入到34％/51％的Percol1分離液的液面上，4℃，350g離心25min，得液面交界處的巨噬細胞。

6.根據權利要求4所述的羅非魚體外免疫抑制模型的構建方法，其特征在于，外周血白細胞的分離方法如下：隨機抽取羅非魚，MS-222麻醉后，用0.1％KMnO₄進行體表消毒后再用75％酒精棉球擦洗；在無菌的條件下進行尾靜脈抽血，全血與0.1％FCS-L-15培養基按1/1比例稀釋后加入到已盛有60％的Percol1分離液的離心管中，4℃，350g離心15min，得60％液面交界處的白細胞。

7.根據權利要求4所述的羅非魚體外免疫抑制模型的構建方法，其特征在于，脾細胞分離方法如下：隨機抽取羅非魚，MS-222麻醉后，用0.1％KMnO₄進行體表消毒后再用75％酒精棉球擦洗；在無菌的條件下，剖取羅非魚脾臟，加入PBS研磨，然后加入5倍體積的PBS，1500g離心10min，棄上清；加入5-10倍細胞體積的紅細胞裂解液重懸細胞后，室溫靜置5min，1500g離心5min，棄上清，PBS洗滌3次，5％FCS-L-15重懸細胞。

8.根據權利要求3所述的羅非魚體外免疫抑制模型的構建方法，其特征在于，羅非魚體重為150±5g；羅非魚的飼養條件為27±2℃，pH6.8-7.6，DO5mg/L，NH₃0.05mg/L，H₂S0.01mg/L；每天投喂量為魚體質量的2％。

9.根據權利要求3所述的羅非魚體外免疫抑制模型的構建方法，其特征在于，免疫細胞預培方法如下：采用臺盼藍法進行細胞活性檢測并計數，調整細胞濃度為10⁷個/mL，接種到96孔板上，每孔100μL，27℃培養2h后，洗去未貼壁細胞，加入100μL/孔5％FCS-L-15培養基，27℃培養。

10.由權利要求1-9任一所述方法構建獲得的羅非魚體外免疫抑制模型。