[發明專利]基于小麥鉀轉運蛋白基因的功能標記開發方法

在審

• 申請號: 202110016384.6
• 申請日: 2021-01-07
• 公開（公告）號: CN112680505A
• 公開（公告）日: 2021-04-20
• 發明（設計）人: 李鴿子;康國章;柳海濤;王鵬飛;劉金
• 申請（專利權）人: 河南農業大學
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 廣東省暢欣知識產權代理事務所(普通合伙) 44631
• 代理人: 耿佳

1.基于小麥鉀轉運蛋白基因的功能標記開發方法，其特征在于：包括以下操作步驟：

S1.提取小麥基因組DNA；

S2.對小麥基因組DNA用限制性內切酶進行酶切，得到小麥鉀轉運蛋白基因HAK1序列，

HAK1序列對：上鏈：TTGGATCCAGAAGGGGTGAAC，

下鏈：ACAAGATAGGTCGCATACTGG；

S3. 對小麥鉀轉運蛋白基因HAK1的5′端進行處理，對PCR擴增引物對進行染色標記，然后對小麥鉀轉運蛋白基因HAK1進行PCR擴增，獲得PCR擴增產物，

PCR擴增引物對：上鏈：TGGAAGCGGAACGGATGAGGA，

下鏈：CTGCGGGAACGAGGGAGTGTC；

S4.對PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，染色后在紫外線下觀察小麥鉀轉運蛋白基因HAK1。

2.根據權利要求1所述的基于小麥鉀轉運蛋白基因的功能標記開發方法，其特征在于：所述步驟S1包括以下操作步驟：

a.稱取0.1-0.3g的小麥籽粒于預冷的研缽中，加入2-3倍體積(W/V，約300-500μl) 提取緩沖液，在冰盤上研磨，研碎后轉入一EP管中；

b.再加約300-500μl提取緩沖液，加入20％SDS至終濃度為2％，約 60-70μl，輕輕混勻后于60-70℃水浴，10-15min，加入1/10體積的5mol/L醋酸鉀(約60-70μl)，于水浴中反應20-40min，離心（10-20krpm,10-20min,3-5℃）；

c.取上相轉入一新的EP管中，用等體積的酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）抽提一次（上下晃動幾次即可），離心（10-20krpm,10-20min,15-25℃）；

d.取上相轉入一新的EP管中，加入等體積的異丙醇，于室溫下反應5-10min，其間將管至少顛倒5-7次，離心（10-20krpm,10-20min,3-5℃）；

e.棄上清液，用70％乙醇沖洗沉淀物，真空抽干或吹干，最后溶于1×TE中（約40-60μl），提取出小麥基因組DNA。

3.根據權利要求1所述的基于小麥鉀轉運蛋白基因的功能標記開發方法，其特征在于：所述瓊脂糖凝膠電泳的濃度為0.5～2%，電泳時電場強度為5-20V/cm，電泳溫度為20-40℃，所述瓊脂糖凝膠電泳采用的核酸染色劑是溴化乙錠。

4.根據權利要求1所述的基于小麥鉀轉運蛋白基因的功能標記開發方法，其特征在于：所述PCR擴增變形的溫度為93-95℃，持續1-3min，所述PCR擴增退火的溫度為50-65℃，持續20-40s，所述PCR擴增延伸的溫度為70-80℃，持續20-40s。