[發(fā)明專利]一種快速分離三七圓斑病菌單個(gè)分生孢子的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110015565.7
• 申請(qǐng)日: 2021-01-06
• 公開（公告）號(hào): CN112592831A
• 公開（公告）日: 2021-04-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何霞紅;楊寬;郭力維;黃紅蘋;魏朝霞;王慧玲;葉坤浩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/02
• 分類號(hào): C12N1/02;C12N1/14;C12N3/00;C12R1/645
• 代理公司: 北京盛凡智榮知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11616
• 代理人: 李朦

本發(fā)明公開了一種快速分離三七圓斑病菌單個(gè)分生孢子的方法，(1)將田間采集回來的三七圓斑病葉片在常溫下風(fēng)干；(2)在生物顯微鏡下觀察病斑部位，尋找分生孢子密集處，用移液槍吸取10μL無菌水打到該部位并反復(fù)抽吸4?5次，病斑上的分生孢子將進(jìn)入到無菌水當(dāng)中成為孢子懸浮液，然后把孢子懸浮液吸取到水瓊脂培養(yǎng)基上并輕輕涂勻。(3)立即在顯微鏡下尋找水瓊脂培養(yǎng)基表面的分生孢子，然后用滅菌挑針蘸取無菌水后移至孢子處吸附單個(gè)孢子；(4)將吸附有單個(gè)孢子的挑針在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行多次劃線，用封口膜封口后在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本發(fā)明直接利用挑針上無菌水的粘附作用獲得單個(gè)分生孢子，分離效果更加精準(zhǔn)，且不容易污染。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及孢子分離技術(shù)領(lǐng)域，具體是指一種快速分離三七圓斑病菌單個(gè)分生孢子的方法。

背景技術(shù)

三七圓斑病病原菌為槭菌刺孢(Mycocentrospora acerina(Hartig)Deighton)，該菌屬于半知菌門菌刺孢屬真菌，該病于1993年云南省文山州首次被發(fā)現(xiàn)，是危害三七地上部分非常嚴(yán)重的一種病害。槭菌刺孢喜低溫高濕，且傳播迅速，在三七生長(zhǎng)地區(qū)，每年雨季來臨，如果防治不及時(shí)，發(fā)病率可達(dá)80％以上，在極端條件下，三七圓斑病可造成三七絕產(chǎn)，對(duì)七農(nóng)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。槭菌刺孢于1880年首次在德國報(bào)道侵染槭樹葉片，該菌主要分布于歐洲和北美洲，寄主范圍廣泛，寄生于槭樹科、十字花科、茄科等16科植物上，在低溫高濕的條件下引起胡蘿卜、萵苣、報(bào)春花等多種蔬菜和觀賞植物病害(傅俊范等，1995)。目前，槭菌刺孢在我國被報(bào)道可引起兩種植物病害，一種是細(xì)辛葉枯病，另外一種是三七圓斑病，均可對(duì)寄主造成毀滅性傷害。(傅俊范等，1995；陳克等，1997).

槭菌刺孢以厚垣孢子在土壤或植物病殘?bào)w中越冬，是翌年三七圓斑病的主要初侵染源，常在每年雨季發(fā)病和流行，發(fā)病初期葉片病斑較小，呈圓形或近圓形水漬狀，病斑中心可見棕褐色侵染小點(diǎn)，隨后病斑逐漸擴(kuò)大，褐色或灰褐色，可在病斑表面觀察到輪紋狀白色、灰色或粉白色的分生孢子堆。這些分生孢子可借助風(fēng)力或雨水飛濺傳播，造成三七圓斑病的大面積發(fā)生。槭菌刺孢分生孢子梗短小粗壯，全壁芽生合軸式產(chǎn)孢，孢痕明顯。分生孢子長(zhǎng)(60-)150-200(-290)μm、寬的部分約8-15μm，分生孢子具(4-)8-11(-24)個(gè)隔膜；有時(shí)在基部細(xì)胞下方的側(cè)面具有一個(gè)向下的刺狀附屬絲。

槭菌刺孢由于很難在人工培養(yǎng)基上產(chǎn)生分生孢子，目前還沒有一種可靠的技術(shù)手段可以使槭菌刺孢在人工培養(yǎng)基上穩(wěn)定的產(chǎn)生分生孢子，因此對(duì)于槭菌刺孢單孢菌株的獲得，則需從田間三七圓斑病發(fā)病葉片病斑上直接分離。CN102140432A公開了一種真菌單個(gè)孢子的分離方法，主要步驟是將玻璃毛細(xì)管從尖端插入巴斯德吸管中，用解剖針挑取待分離的真菌材料，將毛細(xì)管管口中心正對(duì)并接近孢子，轉(zhuǎn)移孢子至培養(yǎng)基上方，真孢分離完成。其關(guān)鍵步驟是用解剖針挑取部分待分離的真菌菌落或病斑組織，而對(duì)于病斑組織而言，上面不一定有分生孢子，且直接取病斑組織做孢子懸浮液，雜質(zhì)較多，且不容易使孢子分散。另外其使用的工具包括巴斯德吸管和毛細(xì)管，將單個(gè)孢子吸到毛細(xì)管中，保持膠頭不動(dòng)，對(duì)操作人員的技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)要求很高，不適宜大批量的真菌單孢分離。CN 108587929 A公開了一種快速分離田間稻瘟病斑上稻瘟菌單孢的方法，該方法主要是將含典型稻瘟病單病斑的水稻葉片涂布在水瓊脂培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)所述帶有稻瘟菌分生孢子的水瓊脂板，再于體視顯微鏡下尋找單個(gè)且已萌發(fā)的稻瘟菌分生孢子，再分離該稻瘟菌單孢，得到含有稻瘟菌單孢的瓊脂塊。該方法直接用病斑涂布水瓊脂培養(yǎng)基表面，對(duì)于分生孢子的定位不精準(zhǔn)，其他雜質(zhì)較多，并且需要切割含有單孢的瓊脂塊，操作步驟較多，相對(duì)麻煩。

因此對(duì)三七圓斑病病原的生物學(xué)特性以及致病機(jī)理等方面的研究中，迫切需要開發(fā)一種快速，穩(wěn)定，效率高且適合大批量樣品分離的單孢分離方法。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：一種快速分離三七圓斑病菌單個(gè)分生孢子的方法，包括以下步驟：