[發明專利]草魚黏液IgM重組表達蛋白、多克隆抗體制備方法及其應用

在審

• 申請號: 202110013346.5
• 申請日: 2021-01-06
• 公開（公告）號: CN112876557A
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發明（設計）人: 許國晶;張金路;杜興華;孟慶磊;王志忠;李壯;鞏俊霞;成慧中;張明磊
• 申請（專利權）人: 山東省淡水漁業研究院(山東省淡水漁業監測中心)
• 主分類號: C07K16/00
• 分類號: C07K16/00;C12N15/70;C07K16/42;G01N33/68
• 代理公司: 北京中原華和知識產權代理有限責任公司 11019
• 代理人: 韓富強

本發明涉及一種草魚黏液IgM重組表達蛋白、多克隆抗體制備方法及其應用。本發明草魚黏液IgM重組表達蛋白的制備方法，包括如下步驟：構建黏液IgM表達載體pET28a(+)?IgM；將構建的重組質粒pET28a(+)?IgM轉入大腸桿菌菌株，使用IPTG誘導表達草魚黏液IgM。本發明還涉及一種抗草魚IgM多克隆抗體的制備方法和抗草魚IgM多克隆抗體的應用。本發明為研究草魚黏液IgM的結構、來源、功能提供了重要工具，為草魚疾病的預防及治療提供了重要的技術手段，為其他養殖魚類疾病的防治提供參考。

技術領域

本發明涉及一種多克隆抗體的制備方法及其應用，具體講是一種抗草魚(Paralichthys olivaceus)黏液IgM重組表達蛋白、多克隆抗體制備方法及其應用，屬于魚類分子免疫學技術領域。

背景技術

魚類具有以免疫球蛋白(Ig)為中心的特異性免疫機制，在水環境中，其皮膚、鰓及其分泌的黏液等與外界環境直接接觸，是魚體抵抗外界病毒和細菌入侵的第一道防線，在免疫應答與免疫保護過程中起著極其重要的作用。魚類黏液除含有非特異性免疫成分外，還含有免疫球蛋白。關于魚類黏液免疫球蛋白與血清免疫球蛋白是否有著共同的起源，是否是一樣的，目前還有很多爭議。

草魚作為我國淡水養殖的四大家魚之一，其養殖對我國農業經濟增長具有重要的意義。目前，關于其免疫球蛋白的研究較多，已經報道了IgM、IgZ和IgD三種類型免疫球蛋白，及新型免疫球蛋白IgZ2、IgM-IgZ，其中，IgM、IgZ存在分泌型(即黏液IgM、IgZ)和膜結合型兩種形式。本專利制備抗草魚黏液IgM的多克隆抗體，可以為闡明IgM的結構、來源、功能以及與血清免疫球蛋白的關系等提供有力工具；另外，魚類感染某種病原或接種疫苗后，魚體會產生黏液IgM即分泌型IgM(SIgM)。因此，利用抗草魚黏液IgM的多克隆抗體，通過檢測草魚黏液中IgM的產生，可以進行草魚疾病的早期診斷和疫苗使用效果的評價，對草魚疾病的預防及治療具有重要理論和現實意義，對其他養殖魚類疾病的防治具有參考價值。

發明內容

本發明的目的是提供一種草魚黏液IgM重組表達蛋白及抗草魚黏液IgM多克隆抗體的制備方法；本發明的另一個目的是提供一種抗草魚黏液IgM多克隆抗體的應用。

本發明的目的是由以下技術方案實現的：

一種草魚黏液IgM重組表達蛋白及抗草魚黏液IgM多克隆抗體的制備方法，包括如下步驟：構建黏液IgM表達載體pET28a(+)-IgM；將構建的重組質粒pET28a(+)-IgM 轉入大腸桿菌菌株，使用IPTG誘導表達草魚黏液IgM。優化表達條件通過變復性的方式重溶目標蛋白，Ni柱親和純化獲得目的蛋白。以制備的草魚黏液IgM蛋白作為抗原免疫新西蘭白兔，經過3-4次免疫之后，經免疫學檢測篩選方法，篩選出特異性分泌抗草魚黏液IgM多克隆抗體。

所述的構建黏液IgM表達載體，是設計全長拼接引物獲得草魚黏液IgM基因，經EcoRV及XhoI雙酶切后連接pET28a(+)。

所述的免疫學檢測篩選方法是間接酶聯免疫法和轉印免疫印跡法；其中所述的間接酶聯免疫法是將制備的免疫兔血清與純化的草魚黏液IgM蛋白于96孔酶標板中反應；繼而加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔抗體；450nm工作波長測定各孔光吸收值，篩選抗草魚黏液IgM蛋白的多克隆抗體。所述的轉印免疫印跡法是將制備的抗草魚黏液IgM蛋白的多克隆抗體與轉移至硝酸纖維素膜的草魚黏液IgM蛋白反應，確定該多抗的抗原決定簇是分子量為62.50kDa的草魚黏液IgM蛋白。

一種所述抗草魚黏液IgM多克隆抗體的應用，包括如下步驟：利用ELISA分析滅活柱狀黃桿菌免疫草魚后黏液IgM免疫應答規律；用免疫組織化學染色法定位草魚黏液IgM在系統及黏膜組織中的分布。

所述的ELISA是將收集免疫后的草魚皮膚黏液、鰓黏液、腸黏液及膽汁包被至96孔板，多克隆抗體孵育；繼而加入HRP標記的羊抗兔抗體；分析免疫后各分泌液中IgM 蛋白水平變化。