[發(fā)明專利]抗草魚pIgR多克隆抗體的制備方法及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110012376.4
• 申請(qǐng)日: 2021-01-06
• 公開（公告）號(hào): CN112552405A
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許國(guó)晶;孟慶磊;張金路;杜興華;成慧中;王志忠;鞏俊霞;李壯;張明磊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東省淡水漁業(yè)研究院(山東省淡水漁業(yè)監(jiān)測(cè)中心)
• 主分類號(hào): C07K16/28
• 分類號(hào): C07K16/28;C07K16/06;C12N15/70;C07K14/705;G01N33/68;G01N33/543
• 代理公司: 北京中原華和知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11019
• 代理人: 韓富強(qiáng)

本發(fā)明涉及一種抗草魚pIgR多克隆抗體的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明抗草魚pIgR的制備方法，包括如下步驟：構(gòu)建pIgR表達(dá)載體pET28a(+)?pIgR；將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET28a(+)?pIgR轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株，使用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)草魚pIgR。本發(fā)明還涉及一種所述抗草魚pIgR多克隆抗體的應(yīng)用。本發(fā)明為研究草魚pIgR蛋白的結(jié)構(gòu)、來(lái)源、功能及與免疫球蛋白的關(guān)系中的應(yīng)用提供了重要工具，為草魚pIgR在黏膜免疫防御的過(guò)程中起到的作用研究提供了重要的技術(shù)手段。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種多克隆抗體的制備方法及其應(yīng)用，具體講是一種抗草魚(Paralichthys olivaceus)多聚免疫球蛋白受體重組蛋白的多克隆抗體制備方法及其應(yīng)用，屬于魚類分子免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

在哺乳動(dòng)物中，多聚免疫球蛋白受體pIgR能夠與分泌型多聚免疫球蛋白(IgA或IgM)形成復(fù)合物，pIgR經(jīng)蛋白酶裂解切割后為分泌成分，從而形成分泌型免疫球蛋白阻止病毒、細(xì)菌、毒素和外來(lái)異物對(duì)黏膜組織的黏附和入侵。因此，pIgR的有效分泌是IgA或IgM發(fā)揮黏膜防御功能的必要條件。

魚類雖然是低等脊椎動(dòng)物，但它仍有與高等脊椎動(dòng)物類似的較為完善的免疫系統(tǒng)。研究表明硬骨魚的皮膚及腸道和哺乳動(dòng)物的腸道采用同樣的免疫球蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，即能夠通過(guò)上皮細(xì)胞中的pIgR轉(zhuǎn)運(yùn)四聚體免疫球蛋白進(jìn)入黏液而發(fā)揮其免疫功能。制備抗草魚多聚免疫球蛋白受體的多克隆抗體，可以為闡明多聚免疫球蛋白受體的結(jié)構(gòu)、來(lái)源、功能以及與免疫球蛋白的關(guān)系等提供有力工具；另外，魚類感染某種病原或接種疫苗后，魚體會(huì)產(chǎn)生pIgR與免疫球蛋白復(fù)合物即分泌型免疫球蛋白(SIgs)。因此，利用抗草魚多聚免疫球蛋白受體的多克隆抗體，通過(guò)檢測(cè)草魚黏液中多聚免疫球蛋白受體的產(chǎn)生，可以進(jìn)行草魚疾病的早期診斷和疫苗使用效果的評(píng)價(jià)，對(duì)草魚疾病的預(yù)防及治療具有重要理論和現(xiàn)實(shí)意義，對(duì)其他養(yǎng)殖魚類疾病的防治具有參考價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種抗草魚pIgR多克隆抗體的制備方法；本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種抗草魚pIgR多克隆抗體的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種所述抗草魚pIgR的制備方法，包括如下步驟：構(gòu)建pIgR表達(dá)載體pET28a(+)-pIgR；將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET28a(+)-pIgR轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株，使用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)草魚pIgR。優(yōu)化表達(dá)條件通過(guò)變復(fù)性的方式重溶目標(biāo)蛋白，Ni柱親和純化獲得目的蛋白。以制備的草魚pIgR蛋白作為抗原免疫新西蘭白兔，經(jīng)過(guò)3-4次免疫之后，經(jīng)免疫學(xué)檢測(cè)篩選方法，篩選出特異性分泌抗草魚pIgR多克隆抗體。

所述的構(gòu)建pIgR表達(dá)載體，是設(shè)計(jì)全長(zhǎng)拼接引物獲得草魚pIgR基因，經(jīng)EcoRV及XhoI雙酶切后連接pET28a(+)。

所述的免疫學(xué)檢測(cè)篩選方法是間接酶聯(lián)免疫法和轉(zhuǎn)印免疫印跡法；其中所述的間接酶聯(lián)免疫法是將制備的免疫兔血清與純化的草魚pIgR蛋白于96孔酶標(biāo)板中反應(yīng)；繼而加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔抗體；450nm工作波長(zhǎng)測(cè)定各孔光吸收值，篩選抗草魚pIgR蛋白的多克隆抗體。所述的轉(zhuǎn)印免疫印跡法是將制備的抗草魚pIgR蛋白的多克隆抗體與轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜的草魚pIgR蛋白反應(yīng)，確定該多抗的抗原決定簇是分子量為27.64kDa的草魚pIgR蛋白。

一種所述抗草魚pIgR多克隆抗體的應(yīng)用，包括如下步驟：利用ELISA分析滅活柱狀黃桿菌免疫草魚后pIgR及SIgs免疫應(yīng)答規(guī)律，弄清pIgR表達(dá)與SIgs免疫應(yīng)答關(guān)系；轉(zhuǎn)印免疫印跡法檢測(cè)并分析草魚血清及黏液中的plgR；用免疫組織化學(xué)染色法定位草魚pIgR在系統(tǒng)及黏膜組織中的分布。

所述的ELISA是將收集免疫后的草魚皮膚黏液、鰓黏液、腸黏液及膽汁包被至96孔板，多克隆抗體孵育；繼而加入HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體；分析免疫后各分泌液中pIgR(SC)蛋白水平變化。