[發明專利]一種用于檢測膠原蛋白的光電化學免疫傳感器的制備方法在審
| 申請號： | 202110011381.3 | 申請日： | 2021-01-06 |
| 公開（公告）號： | CN112858438A | 公開（公告）日： | 2021-05-28 |
| 發明（設計）人： | 王秉;周晴晴;傅悅悅;彭志勤;萬軍民 | 申請（專利權）人： | 浙江理工大學 |
| 主分類號： | G01N27/36 | 分類號： | G01N27/36;G01N33/68;G01N33/543;C07K14/78;C07K1/34 |
| 代理公司： | 浙江永航聯科專利代理有限公司 33304 | 代理人： | 蔡鼎 |
| 地址： | 310018 浙江省杭州市錢塘*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 用于 檢測 膠原 蛋白 光電 化學 免疫 傳感器 制備 方法 | ||
1.一種用于檢測膠原蛋白的光電化學免疫傳感器的制備方法，其特征在于包括以下步驟：
步驟1：膠原蛋白的提取：將15-20g新鮮牛皮切成0.5-1cm的小塊，清水清潔，加入8-12ml 質量分數為5-10%的碳酸鈉溶液作為脫脂液，繼續加入40-50ml的35-45℃溫水，攪拌10-15min，過濾并再重復一次上述操作；放入20-25ml 3%醋酸中40-50h后離心1-3h，離心速率為7000-8000r/min，吸取上清加入25-35%濃鹽水10-15ml，鹽析25-30min后，將沉淀溶入15-20ml 0.1%醋酸內，置透析袋內，用截留分子量為7000-13000的纖維素透析袋在20-25ml1mol/L的HCl溶液中透析2-3天，并每隔4-5h換一次水，其間換水4-6次；向透析所得產物加入氯仿，敞開容器口，用無菌紗布包住，置無菌工作臺使氯仿揮發，得到膠原溶液，真空冷凍干燥，備用；
步驟2：錳卟啉納米材料的制備：往反應容器中通入氮氣進行脫氣，8-10 min后加入100-120 ml的N，N-二乙基甲酰胺，加熱至微沸回流，然后加入80-90mg的四磺酸苯基卟啉，攪拌8-10 min至澄清透明，再加入90-100 mg氯化錳，在100-110℃、氮氣氣氛下機械攪拌，6-10 h后將反應產物冷卻至室溫，并傾入120-130 ml的去離子水中，靜置3-5 h，過濾，濾餅依次用水和乙醇分別洗滌；所得粗產物以試劑級硅膠為吸附劑，三氯甲烷/甲醇溶液為淋洗劑，收集第一粉色帶，真空旋蒸得到錳卟啉納米管，放入干燥器中，保存備用；
步驟3：g-C3N4-MoS2納米復合材料的制備：將盛有4.8-5.0g白色三聚氰胺粉末的帶蓋坩堝放入馬弗爐中，在500-550℃下煅燒3-5h，待自然冷卻到室溫，將黃色g-C3N4產物研磨成粉末，然后將1g g-C3N4粉末放入80-120ml 5M的HNO3溶液中，在120-125℃下回流20-30h冷卻后，離心，并用去離子水清洗至pH為6.8-7.2；最后在30-35℃的真空烘箱中干燥101-5h，制得羧基化g-C3N4；通過在40-50ml超純水中溶解摩爾比為1:4-6的鉬酸鈉和硫脲來制備MoS2，取羧基化的g-C3N4加入MoS2溶液中，并進行水熱反應；最后，收集冷卻的樣品，用超純水洗滌，并在氮氣保護下進行干燥，備用；
步驟4：免疫磁珠與Ab2的核-殼結構制備：取1-1.2 mg羧基磁珠于離心管中，用180-200μl去離子水洗一次，除去上清；接著用150-250 μl 100 mM MES洗1-2次，除去上清；加入MES重懸，加入稀釋的Ab2，震蕩反應；加入EDC溶液，800-1000 rpm/min反應1.5-2.5 h，去除上清，得到負載Ab2的免疫磁珠；先后用PBST清洗， PBS清洗，加入400-600 μL TT buff震蕩反應20-40 min，去除上清，用PBS清，后用BSA溶液封閉4-6 h；加入0.8-1.2 ml含0.01% Tween20和0.02% NaN3的PBS溶液震蕩混勻即得到免疫磁珠混合液，冷藏備用；
步驟5：ITO導電玻璃電極預組裝：分別用丙酮、乙醇、去離子水超聲清洗10-20min，氮氣吹干，之后用氟化密封膠帶包裹ITO電極使之有效面積固定為0.14-0.18cm2，向電極上滴加步驟2所得錳卟啉、步驟3所得g-C3N4-MoS2與CS乙酸溶液；再將該電極放入硅膠干燥盒中室溫下干燥，烘干，得到g-C3N4-MoS2/ITO電極，用超純水蘸洗以除去表面未結合的錳卟啉、g-C3N4 -MoS2和CS，接著將10-15ul的1%GA溶液滴在電極上并在室溫下保持0.5-1.5h，之后用去離子水洗掉過量的GA；將8-12ul的10ul/ml步驟1所得膠原蛋白的CB溶液滴加到電極表面，使其端氨基與GA的醛基結；
步驟6：構建間接型免疫探針：用PBS緩沖液徹底清洗去除步驟5中未與電極表面結合的抗原后，再用10-15 ul 的1 % BSA在35-40 ℃下將電極封閉20-40 min，隨后，用1%的BSA封閉0.5-1.5h，以封閉電極表面可能存在的非特異性結合位點，取出后用PBS緩沖液洗凈，繼續滴加5-10ul 1ul/ml的兔抗膠原蛋白抗體溶液，即Ab1溶液，置于25-35℃中50-70min，用PBS緩沖液洗凈未固定的Ab1，最后滴加8-12ul的步驟4所得負載Ab2的免疫磁珠，置于30-35℃中50-70min，用PBS緩沖液洗凈未固定的免疫磁珠，將電極置于檢測底液中，即完成光電化學免疫傳感器的組裝。
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