[發(fā)明專利]一種糞便微生物多樣性的自動(dòng)化分析方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110008338.1
• 申請(qǐng)日: 2021-01-05
• 公開（公告）號(hào): CN112614540A
• 公開（公告）日: 2021-04-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 羅奇斌;申玉林;廖勝光;任毅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津奇云諾德生物醫(yī)學(xué)有限公司
• 主分類號(hào): G16B20/00
• 分類號(hào): G16B20/00;G16B45/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，且公開了一種糞便微生物多樣性的自動(dòng)化分析方法，包括原始下機(jī)數(shù)據(jù)過濾和質(zhì)量控制、宿主基因組比對(duì)、微生物菌群物種注釋和比對(duì)、微生物菌群代謝潛能分析、微生物多樣性分析、結(jié)果統(tǒng)計(jì)和輸出等步驟。所有步驟使用Python腳本連接實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析，減少了繁瑣的人工操作，降低了人工操作帶來的各種錯(cuò)誤，方法在計(jì)算了香農(nóng)多樣性指數(shù)和辛普森多樣性指數(shù)的同時(shí)，也分析出了樣本中的不同微生物菌群的豐度和代謝通路等信息，有助于更加全面地了解糞便微生物多樣性，流程在運(yùn)行時(shí)不僅會(huì)輸出各步驟產(chǎn)生的中間結(jié)果，也會(huì)對(duì)相應(yīng)的數(shù)據(jù)做統(tǒng)計(jì)分析及整理，輸出相應(yīng)的圖表，方便使用者的瀏覽，同時(shí)流程運(yùn)行日志記錄所有流程相關(guān)信息，方便在流程運(yùn)行出錯(cuò)時(shí)進(jìn)行篩查。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體為一種糞便微生物多樣性的自動(dòng)化分析方法。

背景技術(shù)

糞便微生物即從生物糞便中提取分離的所有微生物，也指腸道菌群微生物，這類微生物數(shù)量龐大種類眾多，在依靠腸道生活的同時(shí)，也幫助宿主完成多種生理生化功能。人類的腸道不僅是消化吸收的重要場(chǎng)所，同時(shí)也是免疫系統(tǒng)的一部分，可在維持正常免疫防御功能中發(fā)揮極為重要的作用，因此人類的腸道微生物還具有人體自身不具備的代謝功能。人類糞便微生物中超過99%的組成部分是細(xì)菌，數(shù)量約10¹¹個(gè)，種類超過1000種，其中97%為厭氧菌、3%為好氧菌。根據(jù)微生物菌群功能可分為有益菌、有害菌和中性菌，機(jī)體健康與其中的有益菌結(jié)構(gòu)種類息息相關(guān)，糞便微生物中不同菌群之間、菌群與宿主之間、菌群宿主與環(huán)境之間始終處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)這種平衡出現(xiàn)失衡狀態(tài)，宿主將表現(xiàn)出患病。研究指出，體魄健康的人糞便或腸道有益菌的比例達(dá)到70%，普通人則是25%，便秘人群減少到15%，而癌癥病人僅有10%或更低。這些微生物菌群組成和多樣性大多反映了個(gè)體的健康狀態(tài)，菌群失衡和多樣性降低可能與結(jié)直腸癌、腹瀉、炎癥性腸炎、慢性代謝性疾病等的發(fā)生發(fā)展都有直接或間接的關(guān)系，因此維持糞便微生物或腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的健康平衡狀態(tài)，對(duì)于個(gè)體健康具有重大意義。

近年來，以細(xì)菌核糖體RNA序列（16S rRNA）分析為基礎(chǔ)的微生物研究技術(shù)迅速發(fā)展，通過對(duì)糞便中分離出的細(xì)菌分類和進(jìn)化標(biāo)記基因16S rRNA基因進(jìn)行測(cè)序，全面深入地反映環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性。獲取了這些糞便微生物的基因序列后，研究其基因序列對(duì)應(yīng)的功能就成了糞便腸道微生物生態(tài)研究的另一個(gè)重要方向，其中主要的技術(shù)是以序列分析為基礎(chǔ)的宏基因組學(xué)（Metagenomics）方法，宏基因組指的是環(huán)境中全部微生物基因組的總和。在宏基因組學(xué)研究中，借助于大規(guī)模序列分析，結(jié)合生物信息學(xué)工具，能夠發(fā)現(xiàn)大量過去無法得到的未知微生物的新基因，這對(duì)了解微生物區(qū)系組成、代謝特點(diǎn)、挖掘具有應(yīng)用潛力的新基因等都有重要意義。

基于宏基因組測(cè)序的微生物分析過程一般包括原始數(shù)據(jù)質(zhì)控、序列比對(duì)、物種注釋分析、相關(guān)豐度鑒定等，在獲取菌群相關(guān)豐度后根據(jù)研究?jī)?nèi)容再進(jìn)行下游分析。數(shù)據(jù)質(zhì)控常用軟件是Trimmomatic軟件，修剪去除原始數(shù)據(jù)中的接頭（Adapter）和低質(zhì)量序列；序列比對(duì)常使用Bowtie2軟件對(duì)比人類基因組參考序列，并去除比對(duì)上的序列，剩余序列即為微生物組序列，其他常見軟件還包括SOAP、BWA、Martin等；物種注釋分析即將與人類基因組比對(duì)過濾后的數(shù)據(jù)和菌群參考基因組再次進(jìn)行比對(duì)及注釋，最后根據(jù)物種分類信息對(duì)豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，常用的注釋且?guī)в薪y(tǒng)計(jì)功能的軟件有MetaPhlAn2、Kraken、Genometa等。

對(duì)于微生物多樣性的描述常使用香農(nóng)多樣性指數(shù)（Shannon Wiener index）和辛普森多樣性指數(shù)（Simpson's diversity index），二者都可以反映整體中具有不同類型個(gè)體的種類數(shù)量，并且同時(shí)考慮到了不同種類的個(gè)體分布之間的系統(tǒng)性關(guān)系。辛普森多樣性指數(shù)是從概率的角度描述從一個(gè)整體中連續(xù)兩次抽樣所得到的個(gè)體屬于同一種類的概率，指數(shù)值越大，多樣性越低，但是辛普森指數(shù)受種類的均勻度影響，且重視主要種類、忽視稀有種類；香農(nóng)多樣性指數(shù)是從信息論的角度出發(fā)，描述不同種類的個(gè)體出現(xiàn)的紊亂和不確定性，因此香農(nóng)多樣性指數(shù)越高，個(gè)體出現(xiàn)的不確定性越高，多樣性越高。