[發明專利]一種用于檢測HER2基因擴增水平的探針組及其應用

在審

• 申請號: 202110008203.5
• 申請日: 2021-01-05
• 公開（公告）號: CN112795649A
• 公開（公告）日: 2021-05-14
• 發明（設計）人: 祝丹平;魏亮;肖書圣;郭林
• 申請（專利權）人: 武漢友芝友醫療科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6811;C12N15/11
• 代理公司: 武漢藍寶石專利代理事務所(特殊普通合伙) 42242
• 代理人: 廉海濤

本發明涉及基因檢測技術領域，具體涉及一種用于檢測HER2基因擴增水平的探針組及其應用，該探針組由說明書表1所示的核苷酸序列制備得到。在HER2基因的非重復區域，采用多種不同長度的寡核苷酸文庫，在使用盡可能少的探針的基礎上，增加探針分辨率；其在制備的過程中還采用PCR摻入法，保證產物中含有更多的熒光基團，采用上述探針組用于檢測HER2基因的擴增水平，在30分鐘內即可完成石蠟組織樣本的FISH雜交，敏感性高，特異性強且雜交背景干凈、信噪比低。

技術領域

本發明涉及基因檢測技術領域，具體涉及一種用于檢測HER2基因擴增水平的探針組及其應用。

背景技術

表皮生長因子受體(EGFR)通路是影響腫瘤的重要通路，EGFR屬于酪氨酸激酶受體家族，主要在上皮組織細胞表面，包括HER1、HER2、HER3和HER4等成員。其中HER2是原癌基因HER2/neu編碼的一種分子量為185kD跨膜糖蛋白p185，HER2基因擴增與增加細胞分化、局部及遠處轉移、遷移、減少細胞凋亡、加快血管發生、腫瘤侵襲、局部及遠處轉移密切相關。基礎研究表明HER2的過量表達可促進腫瘤細胞的轉移，一方面通過調節上皮細胞鈣黏蛋白等黏附因子的表達來促進遷移，另一方面可啟動多種轉移機制來加快腫瘤細胞的轉移。研究表明，大約25％～30％的浸潤性乳腺癌有HER2基因擴增或蛋白過表達，但是具體的表達對比情況還不明確，因此，準確地檢測HER2狀態不僅能為乳腺癌患者的愈后提供依據，而且是有效治療乳腺癌的前提。

熒光原位雜交(FISH)探針指被熒光標記的已知序列的單鏈核酸，能與待測樣本中互補的單鏈核酸特異性結合，熒光顯微鏡能檢測到雜交熒光的位置，從而定位特定基因在染色體上的位置。熒光原位雜交技術作為一種可視化特定DNA序列的分子細胞遺傳學技術，目前廣泛被應用于染色體畸變的檢測中。

現有的熒光原位雜交技術其存在的最大弊端就是檢測時間長、探針數量多，成本較高且檢測時間往往都在12小時以上，患者在進行檢測時當天很難拿到檢測結果，檢測結果過慢往往也是導致醫患關系緊張的一個重要因素。因此，如何縮短熒光原位雜交技術的檢測時間并保證其準確度是該領域一直在研究的一個重要方向。

發明內容

基于此，本發明的目的在于提供一種新的用于檢測HER2基因擴增水平的探針組，該探針組由說明書表1所示的核苷酸序列制備得到。

作為本發明的一種實施方式，該探針組采用上述核苷酸序列，并在所述核苷酸序列的兩端添加標簽序列得到特征性引物，對所述特征性引物其進行PCR擴增得到。

作為本發明的另一種實施方式，PCR擴增體系中含有Alexa fluor555-dUTP標記的dUTP。

作為本發明的另一種實施方式，5’端標簽序列為：TAATACGACTCACTATAGGG(SEQ IDNO:1)；3’端標簽序列為：CCGCTGAGCAATAACTAGCA(SEQ ID NO:2)。

作為本發明的另一種實施方式，PCR擴增產物標記有熒光材料。

本發明還提供一種上述用于檢測HER2基因擴增水平的探針組的制備方法，包括以下步驟：

S1，以HER2基因的序列為依據，在不含重復序列的區域分別設計含45個堿基/60個堿基/80個堿基的核苷酸序列，設定探針Tm值為50℃，GC含量范圍為40-60％，舍棄包含AAAA/TTTT/CCCC/GGGG的序列后，得到1702條候選核苷酸序列探針，再經過全基因組(hg38)BLAST比對分析后，最終得到共計1245個核苷酸探針序列，具體參見說明書中表1所示；

S2，分別在每條核苷酸序列的5’加上20bp的標簽序列、3’端加上20bp的標簽序列，得到一系列帶有標簽序列的特征性引物，其中5’端標簽序列為：TAATACGACTCACTATAGGG；3’端標簽序列為：CCGCTGAGCAATAACTAGCA；

S3，合成S2中的特征性引物并設計其擴增引物；