[發明專利]甘油酯脂肪酶突變體G28C-P206C及其編碼基因與應用

有效

• 申請號: 202110004098.8
• 申請日: 2021-01-04
• 公開（公告）號: CN112574975B
• 公開（公告）日: 2022-04-01
• 發明（設計）人: 王永華;李力浪;藍東明;楊博
• 申請（專利權）人: 華南理工大學;廣州永華特醫營養科技有限公司
• 主分類號: C12N9/20
• 分類號: C12N9/20;C12N15/55;C12N15/81;C12N1/19;C12P7/6454;C12R1/84
• 代理公司: 廣州廣典知識產權代理事務所(普通合伙) 44365
• 代理人: 萬志香;顧書玲

本發明公開了一種甘油酯脂肪酶突變體G28C?P206C及其編碼基因與應用。該甘油酯脂肪酶突變體G28C?P206C是在甘油酯脂肪酶SMG1中引入二硫鍵，該突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4。與野生型對比，本發明獲得的甘油酯脂肪酶突變體G28C?P206C的T_m提高9.0℃，50℃半衰期提高64.8倍，熱穩定性顯著提高，且相對于野生型，其酶活性更好，更適用于工業領域上的應用。

技術領域

本發明屬于酶工程領域，特別涉及一種甘油酯脂肪酶突變體G28C-P206C及編碼基因與應用。

背景技術

脂肪酶(EC 3.1.1.3)是一種絲氨酸水解酶，不僅能在油水界面水解油脂產生脂肪酸、甘油二酯、甘油單酯和甘油等產物，還可以催化酯化、酯交換、醇解和酸解等反應。甘油三酯脂肪酶能水解或酯化形成甘油三酯、甘油二酯或甘油單酯，而甘油酯脂肪酶只能分解甘油二酯或甘油單酯，不能分解甘油三酯，其參與的酯化反應也只合成甘油二酯或甘油單酯。甘油酯脂肪酶在制備新型結構脂和去除油脂中甘油酯領域發揮重要作用，因此在油脂加工、醫藥、飼料添加劑、食品與營養和化學工業等領域中展現出巨大的市場前景。目前文獻報道的甘油酯脂肪酶數量相對較少，并且只有一種來源于卡門柏青霉的甘油酯脂肪酶被日本天野公司商業化。因此，開發甘油酯脂肪酶意義重大。本實驗室前期篩選到一種來源于球形馬拉色菌的甘油酯脂肪酶SMG1，能用于合成高純度甘油二酯、油脂脫酸和環氧化反應等，但是在使用中發現，其熱穩定性較差，在應用過程中容易失活，造成生產成本的增加，限制了應用范圍，不利于產業化。因此，提高脂肪酶的熱穩定性可以為其產業化應用奠定基礎。而在尋找熱穩定性較好的脂肪酶的時候，由于可突變的位點多且蛋白結構的復雜性，需要既兼顧熱穩定性又要具有較好的酶活性，找到能夠適應工業用的酶并不容易。

發明內容

本發明的目的之一在于提供一種熱穩定性提高的甘油酯脂肪酶突變體G28C-P206C，該突變體還具有較好的比活力。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

一種甘油酯脂肪酶突變體G28C-P206C，其氨基酸構成包括如SEQ ID NO.3所示序列；或其編碼基因包括如SEQ ID NO.4所示序列或其反向互補序列；或其氨基酸構成包括如SEQ ID NO.3所示序列，且該序列存在一個或多個點突變，但生物活性不變。

本發明的另一目的在于提供所述熱穩定性提高的甘油酯脂肪酶突變體G28C-P206C的編碼基因。

一種編碼上述甘油酯脂肪酶突變體G28C-P206C的核苷酸序列。

所述的甘油酯脂肪酶突變體G28C-P206C，為在野生型甘油酯脂肪酶SMG1中通過定點突變以引入二硫鍵獲得。

在其中一些實施例中，其如SEQ ID NO.4或其反向互補序列所示。

本發明還提供了一種含有上述編碼甘油酯脂肪酶突變體G28C-P206C的編碼基因的重組表達載體。

本發明還提供了一種含有上述編碼甘油酯脂肪酶突變體G28C-P206C的編碼基因的重組工程菌株。

本發明的又一目的在于提供所述熱穩定性提高的甘油酯脂肪酶突變體G28C-P206C的應用。

上述熱穩定性提高的甘油酯脂肪酶突變體、所述熱穩定性提高的甘油酯脂肪酶突變體G28C-P206C的編碼基因、重組表達載體、重組工程菌株在制備油脂中的應用。

在其中一些實施例中，所述應用是在制備甘油二酯或甘油單酯中的應用。

本發明的另一目的是提供一種制備甘油二酯或甘油單酯的方法。

一種制備甘油二酯或甘油單酯的方法，所用脂肪酶是上述的甘油酯脂肪酶突變體G28C-P206C。