[發(fā)明專利]誘導(dǎo)外顯子50的跳讀的反義核酸

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202080090310.0
• 申請日: 2020-12-25
• 公開（公告）號: CN114901823A
• 公開（公告）日: 2022-08-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鹽谷由輝子;砂土居裕太;脅玲子;鞭馬奏萌;武田伸一;青木吉嗣
• 申請（專利權(quán)）人: 日本新藥株式會社;國立研究開發(fā)法人國立精神.神經(jīng)醫(yī)療研究中心
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;A61K31/7088;A61P21/04
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務(wù)所 11105
• 代理人: 沈雪

在本說明書中提供高效率地跳讀人抗肌萎縮蛋白基因的第50位外顯子的藥劑。另外，在本說明書中提供誘導(dǎo)人抗肌萎縮蛋白基因的第50位外顯子的跳讀的反義低聚物。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及誘導(dǎo)人抗肌萎縮蛋白基因的第50位外顯子的跳讀的反義低聚物及包含該反義低聚物的醫(yī)藥組合物。

背景技術(shù)

杜興氏肌營養(yǎng)不良癥(DMD)是約3，500人新生男孩中1人發(fā)病的頻率最高的嚴(yán)重的遺傳性進(jìn)行性肌萎縮癥。雖然在嬰幼兒期顯示出與健全人基本上沒有差別的運(yùn)動能力，但從4～5歲時起可觀察到肌力降低。然后DMD患者的肌力降低會進(jìn)一步發(fā)展，至12歲時，DMD患者變得無法行走，在20多歲時因心力衰竭或呼吸衰竭導(dǎo)致死亡。目前，沒有針對DMD的有效治療方法，迫切需要開發(fā)有效的治療藥。

已知DMD的原因是抗肌萎縮蛋白基因的突變。抗肌萎縮蛋白基因存在于X染色體，是由220萬堿基的DNA形成的巨大基因。由DNA轉(zhuǎn)錄至mRNA前體，再通過剪接去除內(nèi)含子，79個外顯子接合并成為與翻譯區(qū)域?qū)?yīng)的11,058個堿基的mRNA。由該mRNA翻譯成3,685個氨基酸，生成抗肌萎縮蛋白。抗肌萎縮蛋白與肌細(xì)胞的膜穩(wěn)定性的保持有關(guān)，為了使肌細(xì)胞不容易破壞，抗肌萎縮蛋白是必需的。DMD患者的抗肌萎縮蛋白基因存在變異，因此在肌細(xì)胞中基本上無法表達(dá)具有功能的抗肌萎縮蛋白。因此，在DMD患者體內(nèi)，無法保持肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，大量的鈣離子流入肌細(xì)胞內(nèi)。其結(jié)果是發(fā)生類似炎癥的反應(yīng)，發(fā)生纖維化，從而使肌細(xì)胞變得難以再生。

貝克(Becker)肌營養(yǎng)不良癥(BMD)的原因也是抗肌萎縮蛋白基因的突變，其癥狀雖然表現(xiàn)出因肌萎縮導(dǎo)致的肌力降低，但通常比DMD輕，肌力降低的發(fā)展慢，在多數(shù)情況下在成年期發(fā)病。可以認(rèn)為DMD與BMD的臨床癥狀的不同在于，由于突變，在抗肌萎縮蛋白的mRNA翻譯為抗肌萎縮蛋白時，氨基酸可讀框被破壞或保持(非專利文獻(xiàn)1)。即，對于DMD而言，由于存在氨基酸可讀框錯位的突變，因此基本上不表達(dá)保持功能的抗肌萎縮蛋白，但對于BMD而言，由于變異而使外顯子的一部分缺失，但保持了氨基酸可讀框，因此可以產(chǎn)生雖然不完全但是有功能的抗肌萎縮蛋白。

作為DMD的治療方法，外顯子跳讀法正在受到期待。該方法是通過改變剪接而修復(fù)抗肌萎縮蛋白的mRNA的氨基酸可讀框，從而誘導(dǎo)表達(dá)部分恢復(fù)了功能的抗肌萎縮蛋白的方法(非專利文獻(xiàn)2)。成為外顯子跳讀的對象的氨基酸序列部分被丟失。因此，在該治療中表達(dá)的抗肌萎縮蛋白比正常的抗肌萎縮蛋白短，但由于保持了氨基酸可讀框，因此部分保持了使肌細(xì)胞穩(wěn)定的功能。由此期待通過外顯子跳讀能使DMD表現(xiàn)出與更輕癥狀的BMD相同的癥狀。外顯子跳讀法經(jīng)過基于小鼠、犬的動物實驗，已經(jīng)在進(jìn)行對人DMD患者的臨床試驗。

可以通過以5’或3’剪接點(diǎn)中任一者或兩者、或者外顯子的內(nèi)部為目標(biāo)的反義核酸的結(jié)合來誘導(dǎo)外顯子跳讀。外顯子僅在兩個剪接點(diǎn)通過剪接體復(fù)合體進(jìn)行識別的情況下包含在mRNA中。因此，通過利用反義核酸靶向剪接點(diǎn)，可以誘導(dǎo)外顯子跳讀。另外可以認(rèn)為，由于外顯子被剪接機(jī)構(gòu)所識別，因此需要將SR蛋白質(zhì)結(jié)合于外顯子剪接增強(qiáng)子(ESE)，即使靶向ESE也能夠誘導(dǎo)外顯子跳讀。

抗肌萎縮蛋白基因的突變隨DMD患者而不同，因此需要與基因突變的部位、種類相應(yīng)的反義核酸。目前為止，西澳大利亞大學(xué)的Steve Wilton等制備了對全部79個外顯子誘導(dǎo)外顯子跳讀的反義核酸(非專利文獻(xiàn)3)，荷蘭的Annemieke Aartsma-Rus等制備了對39種外顯子誘導(dǎo)外顯子跳讀的反義核酸(非專利文獻(xiàn)4)。

可以認(rèn)為全部DMD患者的4％左右能夠通過跳讀第50位外顯子(以下稱為“外顯子50”)來治療(非專利文獻(xiàn)5)。近年來，已經(jīng)有包括申請人在內(nèi)的多個研究機(jī)構(gòu)報告了對于以抗肌萎縮蛋白基因的外顯子50作為外顯子跳讀的靶點(diǎn)的研究(專利文獻(xiàn)1～6；非專利文獻(xiàn)6)。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1：國際公開第2013/100190號