[發明專利]人重組精氨酸酶1的生產方法及其用途

在審

• 申請號: 202080060999.2
• 申請日: 2020-08-28
• 公開（公告）號: CN114729344A
• 公開（公告）日: 2022-07-08
• 發明（設計）人: 斯科特·W·羅林森
• 申請（專利權）人: 安格利亞生物制藥公司
• 主分類號: C12N9/78
• 分類號: C12N9/78
• 代理公司: 北京律誠同業知識產權代理有限公司 11006
• 代理人: 徐金國;吳啟超

1.一種用于生產經純化的重組鈷取代人精氨酸酶的方法，其中所述重組人精氨酸酶(rhARG)包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQ ID NO:1至少98％相同，所述方法包括：

a.在生物反應器中，培養生產rhARG的大腸桿菌細胞；

b.裂解所述大腸桿菌細胞；

c.從裂解物中去除細胞碎片；

d.將所述細胞裂解物加載到陽離子交換柱上；

e.用高鹽溶液洗脫所述rhARG；

f.將洗脫的rhARG與鈷鹽一起孵育以形成鈷取代的rhARG(Co-rhARG)；

g.將所述Co-rhARG施加至陰離子交換柱并收集流通物；

h.將所述流通物施加至第三色譜柱上；以及

i.用高鹽溶液從所述第三色譜柱洗脫所述Co-rhARG。

2.根據權利要求1所述的方法，其中將每升陽離子交換樹脂高達60克的rhARG加載到所述陽離子交換柱上。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其中從所述陽離子交換柱洗脫所述rhARG使用高達約0.5M鹽濃度的高鹽溶液。

4.根據權利要求1或2所述的方法，其中從所述陽離子交換柱洗脫所述rhARG使用約0.1M鹽濃度的高鹽溶液。

5.根據權利要求1或2所述的方法，其中從所述陽離子交換柱洗脫所述rhARG使用約0.0至約0.5M鹽濃度的梯度。

6.根據權利要求1或2所述的方法，其中從所述陽離子交換柱洗脫所述rhARG使用約0.0至約0.2M鹽濃度的梯度。

7.根據權利要求1至6中任一項所述的方法，其中所述鈷鹽包含Co²⁺鹽。

8.根據權利要求1至7中任一項所述的方法，其中所述鈷鹽包含CoCl₂。

9.根據權利要求1至8中任一項所述的方法，其中所述第三色譜柱包含多模式色譜(MMC)柱。

10.根據權利要求1至9中任一項所述的方法，其進一步包括使所述rhARG或Co-rhARG與聚乙二醇化反應物反應以提供聚乙二醇化的蛋白質。

11.根據權利要求10所述的方法，其中所述聚乙二醇化的蛋白質包含在K16、K32、K38、K40、K47、K67、K74、K82、L87、K88、K152、K154、K171、K222、K223、K312和K321處的聚乙二醇化的氨基酸殘基中的一者或多者。

12.根據權利要求11所述的方法，其中所述聚乙二醇化的蛋白質包含以下項中的一者或多者被聚乙二醇化：約15％至約60％的K16、約35％至約80％的K32、約20％至約85％的K38、約10％至約60％的K40、約10％至約60％的K47、約40％至約90％的K67、約30％至約95％的K74、約30％至約98％的K82、約15％至約65％的K87、約25％至約70％的K88、約25％至約85％的K152、約15％至約65％的K154、約20％至約75％的K171、0％至約30％的K222、0％至約35％的K223、0％至約45％的K312、和0％至約45％的K321。

13.根據權利要求10至12中任一項所述的方法，其中所述聚乙二醇化的蛋白質至少在K16、K32、K38、K40、K47、K67、K74、K82、L87、K88、K152、K154、K171、K312和K321處包含聚乙二醇化的氨基酸殘基。

14.根據權利要求10至13中任一項所述的方法，其中所述聚乙二醇化的蛋白質在K3、K149、K190、K195、K29、K265和K283處不具有聚乙二醇化的氨基酸殘基。