[發明專利]可用于離子交換色譜和質譜分析的方法、組合物和試劑盒

在審

• 申請號: 202080034424.3
• 申請日: 2020-03-06
• 公開（公告）號: CN113811764A
• 公開（公告）日: 2021-12-17
• 發明（設計）人: 王琦;M·A·勞伯;S·伊波利蒂;俞映清
• 申請（專利權）人: 沃特世科技公司
• 主分類號: G01N30/96
• 分類號: G01N30/96;G01N30/34
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 李進;初明明

本公開涉及可用于多種分析物的增強pH梯度陽離子交換色譜的方法、組合物和試劑盒。在各個方面，本公開涉及色譜洗脫試劑盒，該色譜洗脫試劑盒包括(a)具有第一pH并包含第一濃度的第一有機酸鹽的第一水性緩沖溶液和(b)具有第二pH并包含第二濃度的第一有機酸鹽的第二水性緩沖溶液，其中第一有機酸鹽包括第一有機酸銨鹽，其中第二pH大于第一pH，并且其中第二濃度大于第一濃度。在各個方面，本公開涉及在色譜分離中使用此類水性緩沖溶液的方法。

相關申請的交叉引用

本申請要求于2019年3月8日提交的美國臨時專利申請號62/815,514的權益和優先權，其全部內容以引用方式并入。

技術領域

本公開涉及可用于多種分析物的增強梯度離子交換色譜的方法、組合物和試劑盒。

背景技術

離子交換色譜(IEX)已廣泛應用于蛋白質的分離和分析。在IEX中，基于蛋白質與固定相上存在的帶相反電荷的部分的離子相互作用來分離蛋白質。在其中pH低于等電點(pI)的條件下，蛋白質帶正電。隨著流動相pH增加，蛋白質逐漸失去正電荷并變為中性，然后帶負電。在陽離子交換色譜中，帶正電的蛋白質吸附到帶負電的固定相中。可通過鹽或pH梯度機制使這些蛋白質洗脫。在鹽梯度分離中，具有更多電荷的蛋白質需要更高濃度的鹽，而在pH梯度技術中，具有不同pI的蛋白質可通過流動相pH的變化來分離。

在實施過程中，1EX用于分析許多不同類型的生物分子和許多不同類型的蛋白質。可從這些分離中收集大量信息，特別是當將它們應用于蛋白質治療劑的分析時。作為一種類型的蛋白質治療劑，單克隆抗體(mAb)已用于治療許多疾病。作為生產的內在結果，需要仔細表征蛋白質治療劑的翻譯后修飾(PTM)，因為微小的結構差異可對藥物穩定性、效力和功效具有顯著影響。一些修飾，諸如脫酰胺化、唾液酸化、C-末端賴氨酸變異等，引起蛋白質凈電荷的改變。IEX是檢測和監測這些獨特蛋白質變體的形成的有價值的手段。

然而，由于在鹽梯度方法和pH梯度方法兩者中普遍使用高離子強度的非揮發性緩沖液，詳細分析的大多數示例依賴于耗時的離線級分收集或麻煩的多維LC質譜(MS)。更理想的是，期望實現基于有利于與質譜直接耦合的揮發性流動相組合物的優化、穩固的IEX分離。迄今為止，已公布了兩種示例性IEX-MS分析。Leblanc和同事開發了一種用于利用中間朝上方法對mAb進行電荷變體表征的雙鹽/pH梯度方法。Leblanc，Y.；Ramon，C.；Bihoreau，N.；Chevreux，G.，“通過與天然質譜在線聯接的離子交換色譜對單克隆抗體的電荷變體進行表征：在+5℃下長期儲存后的案例研究(Charge variants characterization of amonoclonal antibody by ion exchange chromatography coupled on-line to naivemass spectrometry：Case study after a long-term storage at+5degrees C)”，Journal of chromatography.B，Analytical technologies in the biomedical andlife sciences 2017，1048，130-139。在該工作中，使用揮發性鹽甲酸銨和乙酸銨在3.9至7.4的pH范圍內，在天然條件下用IEX-MS直接分析mAb的IdeS消化亞基。在實踐中，已經證明用該技術獲得的MS的色譜分辨率和質量是不理想的，并且流動相組成由于具有比所需更多的組分而不必要地復雜化，因為其繼續甲酸銨和乙酸銨兩者。最終，鹽加合物的豐度損害了來自該方法的質譜的可判讀性，并且其取決于高鹽濃度。最近，Füssl和同事開發了基于碳酸氫銨、乙酸和氫氧化銨的pH梯度方法。Fussl，F.；Cook，K.；Scheffler，K.；Farrell，A.；Mittermayr，S.；Bones，J.，“使用直接聯接pH梯度陽離子交換色譜進行高分辨率天然質譜的單克隆抗體的電荷變體分析(Charge VariantAnalysis of Monoclonal AmibodiesUsing Direct Coupled pH Gradient Cation Exchange Chromatography to High-Resolution Native Mass Spectrometry.)”Analytical Chemistry 2018，90(7)，4669-4676。該流動相體系在5.3至10.18的pH范圍內提供相對恒定的電導率，以分析具有不同pI的完整mAb。然而，針對每種分析物需要對梯度進行微調，并且由于流動相包含碳酸氫銨，在所得MS譜中容易觀察到二氧化碳加合物。