[發(fā)明專利]生物高分子的濃縮方法、晶化方法以及納米結(jié)構(gòu)基板

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202080024614.7
• 申請(qǐng)日: 2020-04-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113631565A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-11-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 奧津哲夫;伊東正浩;田倉(cāng)章皓
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 國(guó)立大學(xué)法人群馬大學(xué);日本電鍍工程股份有限公司
• 主分類號(hào): C07K1/04
• 分類號(hào): C07K1/04;C07K1/14
• 代理公司: 北京三友知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11127
• 代理人: 褚瑤楊;于潔

本發(fā)明提供生物高分子的濃縮方法、晶化方法以及納米結(jié)構(gòu)基板。通過(guò)利用電磁波在受光面?zhèn)热菀准杏诩怃J的部分的性質(zhì)使電磁波均衡地分散，使放射面?zhèn)鹊谋砻婷娣e(S_A)大于受光面?zhèn)鹊谋趁婷娣e(S_B)(S_A/S_B＞1)，由此形成平穩(wěn)的電場(chǎng)區(qū)域。使還原金微粒群(平均粒徑20nm)自組裝于透明的聚酯樹(shù)脂膜上，并使其沒(méi)入一半而固定。將該基材反復(fù)浸漬于非電解鍍金液，使金粒子析出于金微粒體上。向該納米結(jié)構(gòu)基板滴加10微升的蛋白質(zhì)溶液，使用懸滴蒸氣擴(kuò)散法進(jìn)行晶化。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物高分子的濃縮方法、晶化方法以及濃縮或晶化用納米結(jié)構(gòu)基板，特別是涉及蛋白質(zhì)的濃縮和晶化方法等。

背景技術(shù)

生物高分子有細(xì)胞、蛋白質(zhì)、多糖類、配體、細(xì)胞、抗體、抗原、細(xì)胞器、脂質(zhì)、分裂球、細(xì)胞聚合體、微生物、肽、脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)以及它們的片段等那樣的生物高分子。這樣的生物高分子的濃縮和晶化對(duì)于包括診斷、治療、細(xì)胞生物學(xué)以及蛋白質(zhì)組學(xué)在內(nèi)的數(shù)量膨大的生物醫(yī)學(xué)用途而言至關(guān)重要。例如蛋白質(zhì)的晶化特別是膜蛋白質(zhì)的晶體被期待應(yīng)用于基于X射線的構(gòu)造分析、基因組分析、生物傳感器、醫(yī)藥品等廣泛的用途。

生物高分子的粒徑一般為數(shù)納米至數(shù)10納米的大小，連結(jié)力為從數(shù)皮牛頓至數(shù)百皮牛頓的力。這樣生物高分子的結(jié)合力非常弱，因此以往也提出了使用各種方法濃縮或晶化生物高分子的方法，還提出了包括金屬微粒體的各種納米結(jié)構(gòu)基板。代表性的晶體生長(zhǎng)方法有坐滴法、懸滴法、大批量(日語(yǔ)：バルクバッチ)法、微批量(日語(yǔ)：マイクロバッチ)法等。

生物高分子結(jié)構(gòu)的有力的分析法之一為X射線晶體結(jié)構(gòu)分析，為了獲得高級(jí)結(jié)構(gòu)，需要優(yōu)質(zhì)的晶體。但是很多生物高分子難以晶化，特別是蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)分子具有各向異性，溶解度會(huì)因溶液的溫度、緩沖液的種類、pH、晶化劑的種類等而變化，因此難以晶化。

蛋白質(zhì)分為水溶性蛋白質(zhì)和膜蛋白質(zhì)。在細(xì)胞質(zhì)中流動(dòng)那樣的蛋白質(zhì)是水溶性蛋白質(zhì)，埋在生物膜內(nèi)或一部分與生物膜相接或進(jìn)入生物膜的蛋白質(zhì)是膜蛋白質(zhì)。已知膜蛋白質(zhì)以埋在細(xì)胞膜中的形式存在，因此晶化特別困難。

以往也存在很多使用各種方法成功實(shí)現(xiàn)了膜蛋白質(zhì)的晶化的事例，這些成功事例能夠應(yīng)用于生物高分子的晶化。初期有使用表面活性劑溶解膜蛋白質(zhì)并通過(guò)鹽析使溶解了的膜蛋白質(zhì)凝聚的晶化方法。

例如，日本特開(kāi)2007-230841號(hào)公報(bào)的權(quán)利要求1公開(kāi)了“一種蛋白質(zhì)晶體生成方法，是從蛋白質(zhì)溶液的液滴生成蛋白質(zhì)晶體的蛋白質(zhì)晶體生成方法，其特征在于：包括通過(guò)加速所述蛋白質(zhì)溶液的液滴的蒸氣擴(kuò)散速度來(lái)形成結(jié)晶核的工序(A)”，記載了懸滴法(a)、坐滴法(b)、夾滴法(c)這些放置方法都能使用(該專利公報(bào)第104段)。該方法通過(guò)使用溶劑的吸附劑等，從液滴蒸發(fā)水，其結(jié)果是，使蛋白質(zhì)的濃度連續(xù)增大。

但是如圖12所示，該方法容易在蛋白質(zhì)的單分子間析出鹽成分，難以進(jìn)行純凈的蛋白質(zhì)的晶化。

日本特開(kāi)2014-172833號(hào)公報(bào)的權(quán)利要求1公開(kāi)了“一種膜蛋白質(zhì)的晶化方法，其特征在于：包括制備工序和析出工序，在所述制備工序中，制備包括膜蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、具有有光致異構(gòu)基的疏水性部和親水性部的表面活性劑以及水的組合物；在所述析出工序中，在所述組合物中析出膜蛋白質(zhì)晶體”。該方法因膜蛋白質(zhì)以埋在細(xì)胞膜內(nèi)的形式存在，所以使用表面活性劑使膜蛋白質(zhì)的晶化變得容易。

但是如圖13所示，該方法使表面活性劑成分容易進(jìn)入蛋白質(zhì)的單分子間，難以進(jìn)行純凈的蛋白質(zhì)的晶化。