[發明專利]核酸檢測和引物設計方法

在審

• 申請號: 202080015240.2
• 申請日: 2020-01-22
• 公開（公告）號: CN113490751A
• 公開（公告）日: 2021-10-08
• 發明（設計）人: D·拉夫;D·丁格拉
• 申請（專利權）人: 使命生物公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6811
• 代理公司: 北京市金杜律師事務所 11256
• 代理人: 陳文平;劉盈盈

本文提供了用于檢測來自單細胞的靶核酸的方法。所述方法的優選實施方案包括在單獨的細胞中選擇一個或多個感興趣的靶核酸序列，其中所述靶核酸序列通常與細胞中的細胞DNA和RNA互補，所述細胞DNA包括基因組DNA。提供細胞樣品，并且在優選實施方案中，所述樣品來自單細胞。所述細胞被裂解，并且在單一反應中，可以檢測DNA和RNA兩者，而無需對所述樣品進行細分。這可以通過提供與一種或多種靶核酸互補的核酸擴增引物組，特別是在擴增反應中選擇性擴增特定靶核酸或擴增子的引物組來實現。還提供了用于這些方法的引物設計方法以及用于執行所述方法的設備和系統。

技術領域

本發明整體涉及檢測細胞或生物體中的靶基因或核酸，更具體地涉及從單細胞中的一種或多種靶核酸中檢測并識別DNA和RNA兩者。

相關申請

本申請要求D.Dhingra和D.Ruff于2019年1月22日提交的題為“Method,Systemsand Apparatus for DNA and RNA Primer Design”的美國臨時申請USSN 62/795,171的優先權。

背景技術

基于核酸核苷酸序列互補性的核酸分析方法可以直接分析遺傳性狀。因此，這些方法是識別遺傳疾病、識別和監測癌癥、微生物等的非常有力的手段。

當需要分析包含細胞DNA(包括基因組、染色體外、病毒和線粒體DNA)和RNA的多種靶核酸時，檢測以極少量存在于樣品中的靶基因或核酸(例如來自單細胞)是困難的并且變得甚至更成問題。

需要提供結合了與靶向DNA測序組合的靶向RNA測序的高通量單細胞核酸測序的方法、系統和設備。本文描述的發明滿足了這些未解決的挑戰和需求。

發明內容

本文描述和要求保護的發明具有多個屬性和實施方案，包括但不限于在本發明內容中闡述或描述或引用的那些屬性和實施方案。本文描述和要求保護的發明不限于本發明內容中識別的特征或實施方案，或受這些特征或實施方案的限制，這些特征或實施方案僅出于說明而非限制的目的包括在內。

在一方面，所公開的實施方案通常結合了與靶向DNA測序組合的靶向RNA測序。某些實施方案向單細胞測序工作流程提供基本上組合的靶向RNA測序和靶向DNA測序。在一個實施方案中，該方法基本上不需要將樣品分成RNA和DNA部分。擴增產物(擴增子)在基因組與轉錄組之間可能有重疊覆蓋。一些實施方案部分地通過選擇具有特定序列或引物修飾的引物來提供選擇性擴增DNA或RNA擴增子的方法。DNA和RNA擴增子也可以通過測序來區分并平衡每個擴增子的最佳測序深度。

在另一方面，提供了設計并提供用于選擇性或優先擴增DNA或RNA擴增子的引物的方法。擴增引物還可以在骨架、核苷酸或其他地方包含基于序列或靶核酸類型(例如mRNA或gDNA)而影響(例如減少、阻止或限制)特定擴增子的擴增的化學修飾。

例如，在一些實施方案中，設計并提供引物，其中DNA反向引物被阻斷以便在PCR之前不延伸。在其他實施方案中，DNA反向引物和正向引物被阻斷。在其他實施方案中，擴增反應使DNA反向引物和正向引物被阻斷，以便在PCR之前不延伸。

某些實施方案利用具有替代化學性質的固體珠粒，其中用于DNA和RNA兩者的正向引物均在溶液中。在這些實施方案中，正向引物含有嵌入的PCR退火序列或‘柄(handle)’，其允許與引物雜交。柄是靶序列上游5’的特定尾部。此柄與珠粒條形碼寡核苷酸互補，并充當PCR延伸橋，以將靶擴增子連接到珠粒條形碼文庫引物序列。固體珠包含可以與正向引物上的PCR柄退火的引物。基因特異性RNA反向引物和基因特異性DNA反向引物在溶液中。RNA反向引物可用于逆轉錄。在特定的實施方案中，DNA反向引物被阻斷以便在PCR之前不延伸。本文描述的方法在可以產生的唯一核酸標記的數量方面實際上是不受限制的。