[發明專利]一種農桿菌介導的高效玉米骨干自交系遺傳轉化的方法

在審

• 申請號: 202011644000.7
• 申請日: 2020-12-31
• 公開（公告）號: CN114686511A
• 公開（公告）日: 2022-07-01
• 發明（設計）人: 邢少辰;王云鵬;韋正乙
• 申請（專利權）人: 吉林省農業科學院
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 北京卓嵐智財知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11624
• 代理人: 郭智

1.一種農桿菌介導的高效玉米骨干自交系遺傳轉化的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1，配置誘導培養基；

步驟2，選取外植體取授粉11-16天的幼雌性穗，并對其進行消毒，消毒時采用酒精浸泡8-12分鐘，消毒完成后選取雌穗中部顆粒飽滿大小在1.0-1.6mm的幼胚；

步驟3，將選取的幼胚接種到誘導培養基中，誘導愈傷組織，在黑暗環境培養2-6天，溫度保持在23-28度之間；

步驟4，將愈傷組織與胚芽分離，然后將愈傷組織接種于農桿菌懸浮液中浸染；

步驟5，將浸染后的愈傷組織從農桿菌懸浮液中取出，利用無菌布擦拭干凈，并置于無菌臺面晾干；

步驟6，配置共同培養基；

步驟7，將晾干后的愈傷組織放入共同培養基中，保持溫度在20-25度，光照12-14h/d，光照強度在6000-10000lx直至愈傷組織表面出現菌體即可；

步驟8，再次對愈傷組織進行清洗，清洗后將表面擦拭干凈后，并置于無菌臺面晾干；

步驟9，配置篩選培養基；

步驟10，將愈傷組織接種到篩選培養基中進行抗性篩選，獲取抗性的愈傷組織；

步驟11，配置分化培養基；

步驟12，將抗性愈傷組織接種到分化培養基培養，直至愈傷組織生出幼苗；

步驟13，配置生根培養基；

步驟14，將幼苗接種到生根培養基上生根，獲得玉米自交系轉化苗。

2.根據權利要求1所述的一種農桿菌介導的高效玉米骨干自交系遺傳轉化的方法，其特征在于，所述步驟1中的誘導培養基成分包括，MS鹽3.2～5.0g/L、蔗糖25-30g/L、瓊脂粉13-18g/L、N6維生素0.8-2.2ml/L。

3.根據權利要求1所述的一種農桿菌介導的高效玉米骨干自交系遺傳轉化的方法，其特征在于，所述步驟6中的共同培養基成分包括，MS鹽3.6～5.8g/L、瓊脂粉20-30g/L、葡萄糖50-250ml/L、乙酰丁香酮100～120μmol/L、L-脯氨酸1.6～2.5g/L。

4.根據權利要求1所述的一種農桿菌介導的高效玉米骨干自交系遺傳轉化的方法，其特征在于，所述步驟9中的篩選培養基成分包括，6-BA0.1-0.2mg/mL、Hyg 20-25mg/L、Timentin 200-400mg/L、瓊脂粉10-15g/L、葡萄糖60-300ml/L。

5.根據權利要求1所述的一種農桿菌介導的高效玉米骨干自交系遺傳轉化的方法，其特征在于，所述步驟11中的分化培養基成分包括，Hyg 20-25mg/L、蔗糖25-30g/L、瓊脂粉10-15g/L、酪蛋白水解物0.18～0.22g/L、甘氨酸0.039～0.052g/L、雙丙氨膦3.3～5.1mg/L、天冬氨酸150-250mg/L。

6.根據權利要求1所述的一種農桿菌介導的高效玉米骨干自交系遺傳轉化的方法，其特征在于，所述步驟13中的生根培養基成分包括，蔗渣30-60g/L、草木灰25-45g/L、河沙60-80g/L、活性炭0.5-5％、雙丙氨膦3.7～4.3mg/L、蔗糖27～33g/L。

7.根據權利要求1所述的一種農桿菌介導的高效玉米骨干自交系遺傳轉化的方法，其特征在于，所述步驟4的浸染時間為12-30分鐘。