[發(fā)明專(zhuān)利]雙抗體偶聯(lián)抗癌藥物在大腸癌腫瘤治療中的應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011642642.3
• 申請(qǐng)日: 2020-12-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114681622A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-07-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 萬(wàn)積成
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 北京萬(wàn)華生物工程有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): A61K47/68
• 分類(lèi)號(hào): A61K47/68;A61K47/55;A61K31/7072;A61K39/395;A61P35/00
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本發(fā)明分別利用大腸癌細(xì)胞sw837和細(xì)胞內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF?B186免疫雞，得到兩種IgY抗體，并將IgY(sw837)與抗癌藥物5；氟?2’?脫氧尿酐進(jìn)行偶聯(lián)，獲得抗體偶聯(lián)物，將兩種IgY抗體混合灌服實(shí)驗(yàn)小鼠，試驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)腫瘤有明顯的抑制作用。

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及一種雙抗體IgY，包含一種IgY抗體偶聯(lián)物，能有效地抑制大腸癌腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

背景技術(shù)：

大腸癌是較常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，在全世界范圍內(nèi)其發(fā)病率位居第3～5位，腫瘤相關(guān)死亡率位居第4位。近年來(lái)我國(guó)大腸癌的發(fā)病率逐年上升。現(xiàn)已有好多專(zhuān)著論述大腸癌，其中李世榮專(zhuān)著中專(zhuān)設(shè)立章節(jié)論述大腸癌特異性免疫療法，國(guó)外學(xué)者的相關(guān)資料顯示，單克隆抗體治療大腸癌死亡率和復(fù)發(fā)率分別減少30％～27％。

IgY抗體有耐酸、耐堿、耐酶解等作用，適合口服治療胃腸疾病。

抗體偶聯(lián)藥物的方法-賴(lài)氨酸一步法，暴露在抗體(mAb)表面的賴(lài)氨酸殘基由于其側(cè)鏈的氨基是強(qiáng)親核基因，常被選為偶聯(lián)藥物的位點(diǎn)。每個(gè)免疫球蛋白(IgG)包含80～100個(gè)賴(lài)氨酸殘基，它們中的大部分是充分暴露在分子表面或是反應(yīng)可及的。

賴(lài)氨酸偶連的一個(gè)主要的簡(jiǎn)單化學(xué)反應(yīng)是通過(guò)偶聯(lián)藥物的活化酯與賴(lài)氨酸殘基形成穩(wěn)定的酰胺鍵，其中，活化酯通常選用O-琥珀酰亞胺(O-succinimide)試劑，如N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimidyl，NHS)或N-羥基硫代琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)酯類(lèi)。另一種反應(yīng)是利用酰亞胺脂類(lèi)化合物(如Traut's試劑)與賴(lài)氨酸殘基形成穩(wěn)定脒鍵，脒鍵在生理PH下以質(zhì)子化形式存在，因此可以保留單克隆抗體(mAb)的天然電荷性質(zhì)。不論何種合成策略，藥物抗體偶聯(lián)比率(DAR)往往是較小的，相對(duì)而言，潛在的偶聯(lián)位點(diǎn)卻很多，這就導(dǎo)致了反應(yīng)的隨機(jī)性和產(chǎn)物的異質(zhì)性，并且藥物負(fù)載呈統(tǒng)計(jì)學(xué)分布，這常被稱(chēng)為賴(lài)氨酸偶聯(lián)的“散彈槍隨機(jī)裝載”(random shotgun loading)。

此外，異(硫)氰酸酯可能形成穩(wěn)定(硫)脲連接化學(xué)性質(zhì)也是知得探討的。此方法已經(jīng)廣泛用于抗體的熒光標(biāo)記，如異硫氰酸熒光素。目前的報(bào)道中，此方法還未應(yīng)用到ADC的制備，但已應(yīng)用于喜樹(shù)堿和阿霉素于具有氨基反應(yīng)活性生物聚合物的偶聯(lián)，以及放射性標(biāo)記抗體的制備。

最近有報(bào)道稱(chēng)一種具有特定框架結(jié)構(gòu)的IgG基于氮雜環(huán)丁酮化學(xué)實(shí)現(xiàn)了賴(lài)氨酸的定點(diǎn)偶聯(lián)，該IgG的重鏈各有一個(gè)反應(yīng)活性很高的賴(lài)氨酸，因而提供了兩個(gè)潛在的偶聯(lián)位點(diǎn)。此賴(lài)氨酸的PKa約為6，而非常見(jiàn)的10～11，這使β-內(nèi)酰胺部分容易打開(kāi)，從而形成β-丙氨酸肽鍵。目前，此方法還未應(yīng)用于ADC的制備，但用于多肽偶聯(lián)的詳細(xì)方法已有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明利用大腸癌細(xì)胞免疫雞獲得IgY抗體偶聯(lián)5-氟-2’-脫氧尿酐，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF-B186)作為抗原，免疫雞獲得VEGF-B186的IgY抗體，將兩種抗體混合灌服實(shí)驗(yàn)小鼠，試驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)腫瘤有明顯的抑制作用。

具體實(shí)施方式：

一 免疫原的制備

1.1大腸癌細(xì)胞sw837

大腸癌細(xì)胞sw837，購(gòu)買(mǎi)于上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)202009410。

1.2細(xì)胞內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF-B186)的表達(dá)與純化

1.2.1 VEGF-B186的合成

查閱相關(guān)文獻(xiàn)，選取細(xì)胞內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF-B186)的基因序列，選擇原核表達(dá)載體pET-32a，送去蘇州泓迅生物公司合成，即構(gòu)建表達(dá)載體VEGF-B186，鑒定正確后用于表達(dá)目的蛋白。

1.2.2 VEGF-B186的表達(dá)和純化