[發明專利]創傷弧菌等溫擴增引物、探針、試劑盒與檢測方法

在審

• 申請號: 202011636958.1
• 申請日: 2020-12-31
• 公開（公告）號: CN112646908A
• 公開（公告）日: 2021-04-13
• 發明（設計）人: 周敘全;馮凱霞;陳瑞;陳杰
• 申請（專利權）人: 廣州賽哲生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/63
• 代理公司: 廣州瑞之凡知識產權代理事務所(普通合伙) 44514
• 代理人: 黃愛君

本發明公開了一種創傷弧菌等溫擴增引物，包括上游引物和下游引物；所述上游引物的序列為SEQ ID NO：1；所述下游引物的序列為SEQ ID NO：2。本發明屬于生物檢測技術領域，本發明提供的引物和探針特異性好，提供的試劑盒通過靶向捕獲探針，特異富集目標序列，能夠提高特異性；同時，捕獲探針中含有T7啟動子序列，通過轉錄及逆轉錄反應，放大待測序列，能夠大大提高檢測靈敏度，操作簡便快捷，能夠解決復雜樣本背景對重組酶等溫擴增抑制的問題，解決重組酶等溫擴增的實際應用問題，具有廣泛的應用場景。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，尤其涉及創傷弧菌等溫擴增引物、探針、試劑盒與檢測方法。

背景技術

創傷弧菌(vibrio vulnificus)是普遍生存在海洋中的一種細菌，一旦感染，發病急，病情發展很快，與霍亂弧菌、腸炎弧菌并列為造成人類感染疾病的三大弧菌。接觸創傷弧菌污染的海產或海水，或遭海生魚貝類等刺傷，都可能導致創傷弧菌進入人體并發生感染。感染創傷弧菌后的癥狀包括嘔吐、發燒、腹瀉、低血壓、腫脹和疼痛等，臨床上容易造成嚴重的敗血癥及肢體壞死，需要盡快使用抗生素治療。

等溫擴增技術又稱為恒溫擴增技術，可在恒定溫度下擴增特定的DNA或RNA片段。與常規PCR擴增技術相比，等溫擴增技術對儀器要求低、反應時間短，更能滿足POCT快速實時檢測的要求。現有等溫擴增技術主要包括環介導等溫擴增(LAMP)、依賴于核酸序列擴增技術(NASBA)、滾環擴增技術(RCA)、解旋酶等溫擴增技術(HAD)等，在食品安全和公共衛生防疫等領域得到廣泛的應用。等溫擴增技術雖具有許多優點，但由于樣品背景的復雜性，容易對重組酶等溫擴增產生抑制作用，導致重組酶等溫擴增等技術在實際應用中受到限制。

感染創傷弧菌的危害大，現有技術尚無法對創傷弧菌進行快速、高效檢測，因此，提供創傷弧菌等溫擴增引物、探針、試劑盒與檢測方法具有重要意義。

發明內容

為解決現有技術中存在的問題，本發明提供一種創傷弧菌等溫擴增引物、探針、試劑盒與檢測方法，提供的引物和探針特異性好，結合重組酶等溫擴增技術實現了對創傷弧菌的快速、高效檢測。此外，本發明提供的試劑盒通過靶向捕獲探針，特異富集目標序列，能夠提高特異性；同時，捕獲探針中含有T7啟動子序列，通過轉錄及逆轉錄反應，放大待測序列，能夠大大提高檢測靈敏度，操作簡便快捷，能夠解決復雜樣本背景對重組酶等溫擴增抑制的問題，解決重組酶等溫擴增的實際應用問題，具有廣泛的應用場景。

本發明的目的將通過下面的詳細描述來進一步說明。

本發明提供創傷弧菌等溫擴增引物，包括上游引物和下游引物；所述上游引物(引物F)的序列為CACCGCCGCTCACTGGGGCAGTGGCTGGGTAT(SEQ ID NO：1)；所述下游引物(引物R)的序列為CGATAGTTGAGTTTCACGCCCATCTCGAAATCCG(SEQ ID NO：2)。

本發明還提供創傷弧菌等溫擴增探針，所述探針用于檢測權利要求1所述創傷弧菌等溫擴增引物的擴增產物，其序列由TCTTATTCCAACTTCAAACCGAACTATGACGTTGACGAAGCGCCTGTG(SEQ ID NO：3)修飾得到，修飾后的探針序列為：TCTTATTCCAACTTCAAACCGAACTATGACGT/i6FAMdT/T/idSp/G/iBHQ1dT/ACGAAGCGCCTGTG C3 Spacer。

此外，創傷弧菌等溫擴增試劑盒，其特征在于：包括所述創傷弧菌等溫擴增引物、所述創傷弧菌等溫擴增探針。

優選地，所述創傷弧菌等溫擴增引物的濃度為5～20μmol/L，所述創傷弧菌等溫擴增探針的濃度為5～20μmol/L。

優選地，所述創傷弧菌等溫擴增試劑盒，還包括捕獲磁珠、擴增反應液和重組酶。