[發明專利]一種野生東北接骨木的組織培養方法

在審

• 申請號: 202011635710.3
• 申請日: 2020-12-31
• 公開（公告）號: CN112715362A
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發明（設計）人: 馬盈
• 申請（專利權）人: 黑龍江省林業科學研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 哈爾濱三目知識產權代理事務所(普通合伙) 23214
• 代理人: 劉冰

1.一種野生東北接骨木的組織培養方法，其特征在于：所述方法通過以下步驟實現：

步驟一、外植體的選取步驟：

選取東北接骨木的當年生帶休眠芽的枝條，經水培后，選取帶側芽的莖段做為外植體；

步驟二、外植體的消毒步驟：

將外植體依次使用酒精和升汞進行消毒，將消毒后的外植體兩端各剪去2mm；

步驟三、誘導分化培養的步驟：

將步驟二消毒后的外植體接入初代培養基中培養，形成帶芽外植體；其中，

培養條件為：培養溫度為20～24℃，光照強度為2000lx，光照時間每天12h，培養30天；

初代培養基的成分包括1/2MS、mg/L 6-BA 4.0、0.2mg/L NAA、6.0g/L瓊脂、30g/L蔗糖，初代培養基的pH值為5.8；

步驟四、不定芽增值培養的步驟：

將經步驟三后所得的帶芽外植體接入增殖培養基中培養；其中，

培養條件為：培養溫度為20～24℃，光照強度為2000lx，光照時間每天12h，培養周期為40天；

增殖培養基的成分包括：改良MS、2.0mg/L 6-BA、0.1mg/LNAA、6.0g/L瓊脂、30g/L蔗糖，增殖培養基的pH值為5.8；

步驟五、壯苗培養的步驟：

將經步驟四的增殖培養基中培養成的不定芽逐個切下，并將切下的不定芽接入改良MS培養基中培養；其中，

培養條件為：培養溫度為20～24℃，光照強度為2000lx，光照時間每天12h，培養周期為40天；

步驟六、生根培養的步驟：

將經步驟五的MS培養基中培養的芽接入生根培養基中培養，至此完成野生東北接骨木的組織培養；其中，

培養條件為：培養溫度為20～24℃，光照強度為2000lx，光照時間為每天12h，培養周期為30天；

生根培養基的組成包括：MS、1.0mg/L 6-BA、0.5mg/L NAA、6.0g/L瓊脂、30g/L蔗糖，生根培養基的pH值為5.8。

2.根據權利要求1所述的一種野生東北接骨木的組織培養方法，其特征在于：所述的步驟二中外植體的消毒步驟，具體為：

首先、將外植體用洗滌劑作表面清洗，清除表面的塵土，再將外植體用流水沖洗，放入消毒瓶中；

之后、把裝有外植體的消毒瓶用75％的酒精棉擦拭后放入超凈工作臺，在超凈工作臺上打開裝有外植體的消毒瓶，倒入75％酒精并搖晃消毒瓶，浸泡消毒30s，倒去酒精，用無菌水沖洗外植體3次～5次；

之后、用0.1％HgCl₂浸泡5min，無菌水沖洗4次～5次，并浸泡30min，再用無菌濾紙吸干外植體表面的水分。

3.根據權利要求1或2所述的一種野生東北接骨木的組織培養方法，其特征在于：步驟二中外植體的消毒步驟中，還需確定外植體的尺寸，具體是：

將采集的枝條的側枝去掉，剪成4～5cm的帶芽莖段，置于放有洗衣粉水的燒杯里，用紗布網將燒杯口套住，持續晃動燒杯5min，將盛裝莖段的燒杯用流水沖洗1～2h。

4.根據權利要求3所述的一種野生東北接骨木的組織培養方法，其特征在于：所述的步驟三中，初代培養基中蔗糖的濃度為20g/L，所述的瓊脂的濃度為6.5g/L，且采用氫氧化鈉溶液調節pH值至6.0；

所述的步驟四中，增殖培養基中蔗糖的濃度為20g/L，所述的瓊脂的濃度為6.5g/L，且采用氫氧化鈉溶液調節pH值至6.0；

所述的步驟五中，MS培養基中蔗糖的濃度為20g/L，所述的瓊脂的濃度為6.5g/L，且采用氫氧化鈉溶液調節pH值至6.0。

5.根據權利要求1、2或4所述的一種野生東北接骨木的組織培養方法，其特征在于：所述的步驟三的誘導分化培養的步驟中，還需進行預防褐化的處理步驟；

所述的預防褐化的處理步驟具體為，在第一次接種至培養瓶內后，每隔3天換瓶一次，且換瓶次數為三次。