[發明專利]一種EqHV NS3蛋白的原核表達方法及應用有效
| 申請號： | 202011631775.0 | 申請日： | 2020-12-30 |
| 公開（公告）號： | CN112646810B | 公開（公告）日： | 2023-07-21 |
| 發明（設計）人： | 李守軍;吳李嫣;盧剛;歐嘉俊;邵冉 | 申請（專利權）人： | 華農（肇慶）生物產業技術研究院有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/11 | 分類號： | C12N15/11;C12N15/70;C12N15/66;C12N1/21;C07K19/00;C07K1/22;C07K16/10 |
| 代理公司： | 廣州市科豐知識產權代理事務所(普通合伙) 44467 | 代理人： | 羅嘯秋 |
| 地址： | 526238 廣東省肇慶市高新區創業路5*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 eqhv ns3 蛋白 表達 方法 應用 | ||
1.一種EqHV?NS3蛋白的原核表達方法在用于制備EqHV?NS3蛋白的多克隆抗體中的應用，其特征在于，包括以下步驟：
（1）EqHV?NS3蛋白的原核表達方法：
1）根據EqHV毒株的NS3基因設計引物Sac?I?1893F和Bam?I?1893R，以GD18毒株的反轉錄產物作為模板進行PCR擴增，獲得PCR擴增產物；所述引物的核苷酸序列如下所示：
上游引物Sac?I?1893F：
5’ATCGAGCTC?GATGTCACCTATTACAGCCACTGTCACT?3’?（SEQ?ID?NO：1）；
下游引物Bam?I?1893R：
5’CGCGGATCCCTATCATTAATGGTGATGGTGATGATGATGGTGATGGTGATGATGATGGTGATGGTGATGATGCGTTTGGGTGTCAATCTCGGCCTCCAT?3’?（SEQ?ID?NO：2）；
2）用限制性內切酶Sac?I?和Bam?I?對PCR擴增產物和表達載體pMAL-c5x進行雙酶切；
3）將酶切后的PCR擴增產物和表達載體pMAL-c5x進行連接，得連接產物；
4）將連接產物轉化入大腸桿菌DH5α感受態細胞，篩選獲得陽性菌，提取質粒獲得重組表達載體pMAL-c5x-NS3；
5）將重組表達載體pMAL-c5x-NS3轉化入表達菌感受態細胞Rosetta（DE3），得到含有重組表達載體pMAL-c5x-NS3的重組表達菌；
6）將重組表達菌接入氨芐LB培養基中并加入誘導劑IPTG進行誘導表達；
7）取誘導后的菌液離心，加入結合緩沖液，超聲破碎后離心，取上清液；
8）將上清液加入鎳柱中洗脫獲得純化后的重組NS3蛋白；
（2）EqHV?NS3蛋白的多克隆抗體制備：
①將步驟8）中所得純化后的重組NS3蛋白與Gel?01?ST水溶性佐劑按比例溶解后皮下注射新西蘭大白兔進行首次免疫；
②將步驟8）中所得純化后的重組NS3蛋白與弗氏不完全佐劑按比例乳化，于首次免疫后的第7d、14d、28d、35d皮下注射新西蘭大白兔進行加強免疫；
③免疫完成后于兔耳緣靜脈采血分離血清，測定EqHV多克隆抗體效價和特異性；
④實驗結果符合預期后，于免疫兔心臟采血獲得含有EqHV多克隆抗體的血清并純化。
2.根據權利要求1所述的一種EqHV?NS3蛋白的原核表達方法在用于制備EqHV?NS3蛋白的多克隆抗體中的應用，其特征在于，步驟6）中所述誘導表達的誘導溫度為37℃。
3.根據權利要求1所述的一種EqHV?NS3蛋白的原核表達方法在用于制備EqHV?NS3蛋白的多克隆抗體中的應用，其特征在于，步驟6）中所述誘導表達的誘導時間為6h。
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