[發明專利]用于特異性識別大豆抗原β-伴大豆球蛋白的核酸適配體

在審

• 申請號: 202011626614.2
• 申請日: 2020-12-30
• 公開（公告）號: CN114686484A
• 公開（公告）日: 2022-07-01
• 發明（設計）人: 宋鵬;馬立周;鄧禹
• 申請（專利權）人: 豐益（上海）生物技術研發中心有限公司
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;G01N33/68
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 王潔

本發明提供了一種用于識別大豆抗原β?伴大豆球蛋白的核酸適配體，該適配體具有SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列。使用本發明的核酸適配體不僅具有較好的靈敏度及特異性，并且大大提高了大豆抗原β?伴大豆球蛋白的檢測效率并降低了檢測成本，因此該方法適用于食品及飼料行業大豆及其深加工產品中大豆抗原蛋白的批量檢測。

技術領域

本發明涉及一種核酸適配體，尤其涉及用于特異性識別大豆抗原β-伴大豆球蛋白的核酸適配體。

背景技術

大豆種子蛋白含量很高，栽培種一般為38％左右，野生大豆和半野生大豆可高達50％左右。從氨基酸組成以及必需氨基酸的含量來分析，大豆蛋白是為數不多的可取代動物蛋白的營養佳品之一。但是，大豆中含有胰蛋白酶抑制因子、凝集素、異黃酮、大豆抗原等多種抗營養因子。其中大豆抗原是指能大豆中引起人及幼齡動物發生過敏反應的一類蛋白，阻礙了大豆蛋白在食品及飼料行業中的廣泛應用。特別是，畜禽生產中仔豬和犢牛等幼齡動物易因攝入含有大豆的日糧后引起腹瀉、生長受阻、腸粘膜細胞增生等過敏反應。因而尋求準確、簡單、成本低，快速檢測大豆抗原蛋白的方法對于評價食品及飼料安全性有著重要的現實意義。

已有的研究表明，大豆蛋白根據沉降系數的不同分為2S、7S、11S和15S球蛋白，其中7S和11S球蛋白約占大豆蛋白總含量的87％。7S球蛋白主要包括β-伴大豆球蛋白、γ-伴大豆球蛋白和堿性7S球蛋白。其中β-伴大豆球蛋白是主要的大豆抗原之一。β-伴大豆球蛋白占大豆7S球蛋白的50％以上，由三種不同理化性質的亞單位組成：α′(76kDa)、α(72kDa)和β(54kDa)。

目前，檢測大豆抗原蛋白的方法主要有SDS-PAGE方法、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、免疫印跡及高效液相色譜法。其中SDS-PAGE法只能定性分析，結果不易重復；蛋白質免疫印跡的檢測手段具備一定的準確性，但是在試驗的過程中需要消耗的時間比較長，并且試驗成本比較大，因此在一些常規的生產檢測中受到了限制；高效液相色譜法在使用上比較消耗時間并且儀器相對昂貴，不適合實際生產中的應用。而酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，可進行定性或定量分析，具備操作簡單、快速、適于批量檢測等優點已得到了廣泛的認可，但該方法具有不可規避的缺點：抗體血清制備復雜、不同實驗室之間不能參比、靈敏度和準確度低。因此，以上方法均具有一定的高效性和敏感性，但各自缺點明顯，特別是費用高，耗時長，不適于生產中大量樣品的快速分析，都不適合于食品及飼料行業的大批量檢測。

Hongmin Jia等采用高效液相色譜法分析大豆β-伴大豆球蛋白中的抗原表位Glym 5.0101的含量，雖具有精確度高、可批量檢測等特點，但在實際使用上消耗時間過長且儀器相對昂貴，不適合實際操作。

專利CN 104897902 A等采用多克隆抗體血清的間接Elisa方法分析大豆β-伴大豆球蛋白的含量，該方法雖因具備操作簡單、快速、適于批量檢測等優點已得到了廣泛的認可，但該方法同時具有不可規避的缺點：抗體血清需重復制備、不同實驗室之間不能參比、靈敏度和準確度低等。

專利CN101441222A公開了一種檢測β-伴大豆球蛋白的單克隆抗體及其試劑盒方法，該方法采用抗原表位為PRPQHPERE的氨基酸序列為基礎通過免疫得到單克隆抗體并進一步開發β-伴大豆球蛋白的檢測方法。該方法雖據具有特異性強、靈敏度高等特點，但仍無法避免抗體血清制備復雜、不同實驗室之間不能參比的缺點。

王寅等使用抗原-抗體試劑盒(Elisa法)檢測大豆蛋白產品中β-伴大豆球蛋白等抗原蛋白的含量。研究結果發現產品烘干溫度過高、烘干時間過長時會發生蛋白質變性和美拉德反應，造成檢測時β-伴大豆球蛋白等抗原蛋白的真實含量檢測不準確，造成抗原-抗體方法檢測出現“假陰性”等現象。

李德發院士曾于2018年飼料預消化營養論壇作題為《大豆抗營養因子研究進展》的報告。其中提到β-伴大豆球蛋白亞基的含量變異最大，針對亞基的抗原位點制備得到的單抗所建立ELISA檢測方法，其測定結果可能與理論值出入較大。