[發(fā)明專利]蒲公英甾醇合酶，編碼蒲公英甾醇合酶的基因及其制備和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011625519.0
• 申請日: 2020-12-30
• 公開（公告）號: CN112574981B
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 章焰生;喬瑋博;李長福
• 申請（專利權(quán)）人: 上海大學(xué)
• 主分類號: C12N9/90
• 分類號: C12N9/90;C12N15/61;C12N15/81;C12N1/19;C12P33/00;C12R1/865
• 代理公司: 北京知呱呱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11577
• 代理人: 杜立軍

本發(fā)明公開了一種蒲公英甾醇合酶，編碼蒲公英甾醇合酶的基因及其制備和應(yīng)用。該具蒲公英甾醇合酶活性的蛋白質(zhì)是如下a)或b)或c)或d)的蛋白質(zhì)：1)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白質(zhì)；2)在SEQ ID NO.2所示的蛋白質(zhì)的N端和/或C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；3)將SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到具有相同功能的蛋白質(zhì)。本發(fā)明克隆到一個(gè)關(guān)鍵蒲公英甾醇合酶基因的全長序列，并利用酵母轉(zhuǎn)化技術(shù)鑒定了此蒲公英甾醇合酶基因所編碼的蛋白質(zhì)為多功能環(huán)化酶，能夠催化2,3?氧化鯊烯生成蒲公英甾醇，從而為利用酵母生產(chǎn)蒲公英甾醇提供了一個(gè)必要的基因資源。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蒲公英甾醇合酶，編碼蒲公英甾醇合酶的基因及其制備和應(yīng)用。

背景技術(shù)

蒲公英甾醇廣泛存在于蒲公英中，是蒲公英全草中的藥用活性成分之一。據(jù)報(bào)道，蒲公英甾醇同樣存在于非洲藥用植物綠玉樹中，在綠玉樹的乳汁中含有較多的蒲公英甾醇。蒲公英甾醇，具有抑菌、消炎、鎮(zhèn)痛、預(yù)防癌癥和抗乙型肝炎病毒(HBV)等功效。其對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶具有抑制作用，可用于制備α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制劑，亦可以作為治療糖尿病的藥物。同時(shí)有小鼠實(shí)驗(yàn)表明，蒲公英甾醇對小鼠哮喘和內(nèi)毒血癥具有保護(hù)作用。蒲公英甾醇的生物合成主要是通過氧化鯊烯環(huán)化酶(OSC)環(huán)化2,3-氧化鯊烯而成。目前，關(guān)于2,3-氧化鯊烯環(huán)化酶基因的克隆已有不少報(bào)道，但是有關(guān)合成蒲公英甾醇的基因，以及其相關(guān)的生物合成的工作，國內(nèi)外尚未有報(bào)道。

本發(fā)明首次報(bào)道了蒲公英甾醇合酶的基因序列以及氨基酸序列，并以釀酒酵母為宿主菌，構(gòu)建了含有來源于綠玉樹的蒲公英甾醇合酶基因EtOSC6的重組工程菌，成功實(shí)現(xiàn)了蒲公英甾醇的異源生物合成。

發(fā)明內(nèi)容

為此，本發(fā)明提供蒲公英甾醇合酶，編碼蒲公英甾醇合酶的基因及其制備和應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

本發(fā)明一方面提供一種具蒲公英甾醇合酶活性的蛋白質(zhì)是如下a)或b)或c)或d)的蛋白質(zhì)：

1)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白質(zhì)；

2)在SEQ ID NO.2所示的蛋白質(zhì)的N端和/或C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；

3)將SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到具有相同功能的蛋白質(zhì)；

4)與SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白質(zhì)。

優(yōu)選地，所述標(biāo)簽為6*組氨酸標(biāo)簽、Flag標(biāo)簽、MBP標(biāo)簽、HA標(biāo)簽或c-Myc標(biāo)簽。

本發(fā)明另一方面提供編碼所述的具蒲公英甾醇合酶活性蛋白的基因，其核酸分子為如下(a)或(b)或(c)的基因：

(a)其編碼序列是SEQ ID NO：1所示的cDNA分子或基因組DNA分子；

(b)與(a)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼SEQ ID NO：2所示的蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子；

(c)在嚴(yán)格條件下與(a)或(b)限定的核苷酸雜交，且編碼SEQ ID NO：2所示的蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子。

所述嚴(yán)格條件是在6×SSC(含0.5％SDS)的溶液中，在68℃下雜交，然后用2×SSC(含0.1％SDS)和1×SSC(含0.1％SDS)各洗膜一次。

優(yōu)選地，所述基因來源于綠玉樹。

本發(fā)明另一方面還提供含所述編碼具蒲公英甾醇合酶活性的基因核酸分子的表達(dá)盒。